1，25-二羥維生素D3對哮喘氣道重塑小鼠模型NF-κB信號通路的調控研究

宋穎芳，洪景芳，柳德靈，林慶安，賴國祥

(南京軍區福州總醫院1.呼吸與危重癥醫學科、2.神經外科，福建福州 350025)

核轉錄因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)是一種具有多向調節作用的核轉錄因子。大量臨床實驗研究均證實NF-κB蛋白在哮喘患者氣道中被過度活化［1］。作為哮喘發病機制中最受關注的信號轉導系統之一，其作用滲透氣道重塑機制的多個環節。1，25-二羥維生素D3［1，25-dihydroxyvitamin D3，1，25-(OH)2D3］是體內VitD最重要的活性代謝產物。既往研究均側重于1，25-(OH)2D3調控哮喘免疫應答及慢性氣道炎癥反應［2－3］，但對于其在哮喘氣道重塑的作用及機制未予更多研究闡釋。本課題組前期研究首次發現1，25-(OH)2D3能抑制哮喘狀態下作為氣道重塑結構基礎的氣道平滑肌細胞(airway smooth muscle cells，ASMCs)的高增殖狀態及表型改變［4］。Ramirez等［5］的研究發現 1，25-(OH)2D3能抑制氣道上皮細胞及成纖維細胞中轉化生長因子-β誘導的促纖維化作用及上皮-間質轉化。此外，新近的流行病學調查研究還證實機體的VitD水平與肺功能呈正相關［6］，這些研究結果強烈提示了1，25-(OH)2D3在哮喘氣道重塑中的可能作用。本實驗建立慢性哮喘小鼠氣道重塑模型，直接觀察1，25-(OH)2D3對哮喘小鼠氣道重塑的影響，進一步探討這種抑制效果是否通過1，25-(OH)2D3對NF-κB信號通路的調控起作用。

1 材料與方法

1.1 材料 卵白蛋白(ovalbumin，OVA)、氫氧化鋁及1，25-(OH)2D3(美國 Sigma公司);抗 NF-κB p65、抗IκBα和抗p-IκBα多克隆抗體及ECL發光試劑盒(美國Santa Cruz公司)，NE-PERTM試劑盒(美國Pierce公司);TRIzol試劑(美國Invitrogen公司);反轉錄RT試劑盒(美國Promega公司);Fast-Start SYBR GreenⅠ試劑盒(瑞士Roche公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及哮喘模型的建立 清潔級8～10周齡BALB/c小鼠18只，♂，體質量17～21 g，購自第四軍醫大學動物實驗中心。小鼠于動物房(環境溫度25℃，濕度70%)經適應性飼養1周后按隨機數字表法隨機分為對照組、哮喘組及VitD組，每組6只。參照文獻方法［7］建立哮喘模型并加以改進，哮喘組小鼠于實驗開始d 1、8、15給予腹腔注射200 μl致敏液(OVA 50 μg，氫氧化鋁凝膠5 mg)，從d 22開始為激發階段，麻醉狀態下鼻腔滴入1% OVA溶液50 μl，每天1次，連續1周，而后每周3次，連續8周。VitD組致敏及激發方法同哮喘組并參照文獻［8］的劑量在每次OVA激發前1 h予以腹腔注射100 ng 1，25-(OH)2D3;對照組用等量生理鹽水代替OVA進行致敏和激發。末次激發后24 h處死小鼠。迅速取出左肺下葉用4%多聚甲醛固定并石蠟包埋，切片(厚4 μm)。右肺經液氮冷凍后，置于－70℃凍存，用于總RNA及總蛋白抽提。

1.2.2 肺組織病理分析 石臘切片分別進行HE染色及Masson三色染色，200×光鏡下每個切片隨機采集至少10個150～250 μm直徑的完整支氣管橫斷面，圖像分析軟件測定支氣管基底膜周徑(Pbm)、上皮層面積(WAmuc)、平滑肌層面積(WAm)、平滑肌細胞核數(N)及藍色膠原在氣管基底膜下20 μm的分布面積(Wco1)，并用Pbm標化。

1.2.3 Western blot法檢測NF-κB p65、IκBα和p-IκBα的蛋白表達 使用NE-PERTM試劑盒提取肺組織總蛋白及胞質蛋白、胞核蛋白。10%SDSPAGE分離總蛋白并電轉移至硝酸纖維素膜上，1∶1 000稀釋的抗NF-κB p65、IκBα和p-IκBα抗體分別進行蛋白印記分析，ECL化學發光試劑盒顯像，凝膠圖像分析系統分析各蛋白條帶灰度值，并以β肌動蛋白(β-actin)為內參標化各樣品蛋白電泳條帶的灰度值。用同樣方法再次檢測各組肺組織胞核蛋白及胞質蛋白中NF-κB p65的蛋白表達，并計算NF-κB p65蛋白的胞核表達率(胞核表達量/總蛋白表達量)及胞質表達率(胞質表達量/總蛋白表達量)。

1.2.4 實時熒光定量RT-PCR檢測IκBα的mRNA表達 采用TRIzol試劑提取肺組織總RNA并逆轉錄為cDNA，而后取2 μl cDNA作為反應模板進行PCR擴增。IκBα序列:上游 5'-CCGCACAGCCATGTTTCAG-3'，下游 5'-CATGGAGTCCAGGCCGCTGTCGTG-3'，產物長度125 bp;GAPDH序列:上游5'-AACGACCCCTTCATTGAC-3'，下游5'-TCCACGACATACTCAGCAC-3'，產物長度191 bp。PCR反應條件:IκBα(94℃ 45 s，60℃ 1 min，72℃ 90 s，共30個循環);GAPDH(94℃30 s，55℃30 s，72℃2 min，共30個循環)。反應結束后，記錄每個樣品管中的熒光強度增加到熒光閾值所對應的擴增循環數(Ct)值。以GAPDH為內參照，計算目的基因mRNA的相對含量［目的基因mRNA/GAPDH mRNA= 2－△Ct(△Ct=Cttarget-CtGAPDH)］。

2 結果

2.1 肺組織病理學改變及圖像分析 與對照組相比，哮喘組小鼠氣道壁及氣道平滑肌層明顯增厚，黏膜下水腫，黏膜下層增寬，黏膜皺褶增多，管腔狹窄，有時可見黏液栓堵塞，氣道上皮細胞脫落，黏膜下層及管周有大量炎性細胞浸潤，而1，25-(OH)2D3的干預減輕了上述病變(Fig 1)。

Fig 1 1，25-(OH)2D3treatment attenuates established airway remodeling in a murine model of chronic asthma (HE×400)

圖像分析軟件顯示哮喘組支氣管壁上皮層面積(WAmuc/Pbm)、平滑肌層面積(WAm/Pbm)、膠原沉積面積(Wcol/Pbm)及平滑肌細胞核數量(N/ Pbm)均明顯高于對照組，而VitD組均較哮喘組明顯下降，但仍高于對照組(P＜0.05)，見Tab 1。

Tab 1 Morphometric analysis of airway wall thickness(±s，n=6)

Tab 1 Morphometric analysis of airway wall thickness(±s，n=6)

#P＜0.05 vs the control group;△P＜0.05 vs the asthma group

Group WAmuc/Pbm/ μm2·μm－1 WAm/Pbm/ μm2·μm－1 Wcol/Pbm/ μm2·μm－1 N/Pbm/number· 100 μm －1 Control 7.14±0.51 2.43±0.51 8.37±0.87 1.37±0.31 Asthma 21.57±0.74# 7.18±1.13# 16.73±1.41# 5.02±0.23# VitD 15.33±0.37#△ 4.35±0.97#△10.75±1.14#△ 3.84±0.27#△

Fig 2 1，25-(OH)2D3prevents the nuclear translocation of NF-κB p65 in a murine model of chronic asthma

2.2 肺組織NF-κB p65蛋白的表達及核移位情況VitD組NF-κB p65總蛋白表達量(0.48±0.06)較哮喘組(0.71±0.08)明顯降低(n=6，P＜0.05)，但仍高于對照組(0.31±0.04)(n=6，P＜0.05)，即1，25-(OH)2D3能抑制哮喘肺組織中的NF-κB p65總蛋白表達(Fig 2)。進一步比較NF-κB p65蛋白在胞質及胞核的分布情況，可見VitD組NF-κB p65的胞核表達率為(0.59±0.12)，明顯低于哮喘組(0.78±0.09)(n= 6，P＜0.01)，相應地，VitD組NF-κB p65的胞質表達率(0.41±0.07)較哮喘組(0.22±0.04)明顯增高(n=6，P＜0.01)，說明1，25-(OH)2D3明顯減少了哮喘肺組織中NF-κB p65在胞核中的聚集而相應地增加了其在胞質中的表達，即阻止了哮喘肺組織中NF-κB p65的核移位。

2.3 肺組織IκBα的表達及其磷酸化水平 VitD組IκBα蛋白表達量(0.32±0.04)較哮喘組(0.21 ±0.03)明顯增高，但兩者均低于對照組(0.46± 0.05)(n=6，P＜0.01)，由此可見1，25-(OH)2D3能上調哮喘狀態下的IκBα蛋白表達(Fig 3)。

Fig 3 1，25-(OH)2D3increases the IκBα protein level but decreases its phosphorylation in a murine model of chronic asthma

與蛋白表達結果變化情況相一致，VitD組IκBα mRNA的相對含量(0.33±0.04)明顯高于哮喘組(0.15±0.02)，但兩者均低于對照組(0.53±0.03) (n=6，P＜0.01)。因此1，25-(OH)2D3能明顯上調哮喘肺組織中IκBα的mRNA表達，這是其上調IκBα蛋白表達的主要原因。

IκBα蛋白的降解是影響IκBα蛋白表達的另一重要原因。而磷酸化是IκBα蛋白降解的先決條件。結果顯示(Fig 3)，1，25-(OH)2D3能抑制哮喘肺組織中的p-IκBα蛋白表達。為排除IκBα的表達水平對p-IκBα表達的影響，實驗用IκBα蛋白表達量對p-IκBα蛋白表達量進行標化，結果可見，VitD組p-IκBα/IκBα為(0.41±0.05)，亦明顯低于哮喘組的(0.86±0.04)(n=6，P＜0.05)，但仍高于對照組的(0.17±0.03)(n=6，P＜0.01)。由此可見1，25-(OH)2D3能通過抑制IκBα的磷酸化來抑制IκBα的蛋白降解，這是1，25-(OH)2D3上調IκBα蛋白表達的另一重要原因。

3 討論

近年來氣道重塑已經成為哮喘研究的熱點，它不僅是哮喘慢性化、持續化、嚴重化的病理基礎，而且也是重癥哮喘、難治性哮喘和激素抵抗性哮喘的病理基礎。既往研究表明給予致敏小鼠進行慢性長時程激發可以誘導出具有人類哮喘病理特征的哮喘動物模型［9］。本實驗給予致敏小鼠1%的OVA滴鼻激發9周，結果發現小鼠肺組織存在明顯的炎性細胞浸潤，并出現明顯的結構改變，包括氣道壁上皮層增厚、上皮下膠原沉積及平滑肌層增厚等。說明該動物模型發生了哮喘特異性的氣道炎癥和氣道重塑，慢性哮喘小鼠模型復制成功。

糖皮質激素作為目前哮喘治療的一線用藥，已成為現代哮喘治療的基石，它雖能有效調節哮喘慢性炎癥和免疫紊亂，但對哮喘氣道重塑意義有限［10］。研究證實只有長期且大劑量地運用激素才能改善業已形成的氣道重塑改變，但這樣的激素治療會引起較多的全身性不良反應，限制了它在哮喘氣道重塑治療中的臨床應用［11－12］。其余的哮喘常用治療藥物，如白三烯拮抗劑、長短效β受體激動劑和IgE單克隆抗體等對哮喘氣道重塑的治療作用到目前為止均未得到滿意的結果［10］。因此尋找更安全更有效的藥物成為研究治療哮喘氣道重塑的關鍵。

本研究結果發現1，25-(OH)2D3的運用能有效減輕慢性哮喘氣道重塑的程度，這一結果從新的角度詮釋了1，25-(OH)2D3在哮喘防治中的作用，有力地展示了1，25-(OH)2D3潛在的改善肺功能和氣道重塑的能力。由于1，25-(OH)2D3的結構、作用方式及其生成時的嚴密負反饋調節機制與類固醇激素非常相似，因此它不僅是脂溶性維生素，更被公認為第二甾體類激素。在現有對哮喘發病機制的研究中，1，25-(OH)2D3已被證實能調節慢性氣道炎癥及紊亂的免疫應答，這與激素對哮喘的作用機制亦相類似［2－3］。此外，它還被推薦為臨床治療激素抵抗型哮喘的重要輔助藥物［13］。鑒于1，25-(OH)2D3是一種生物制劑，副作用小且使用依從性好，加之上述提及的在哮喘防治中與類固醇激素諸多的相似作用，1，25-(OH)2D3理所當然將會成為哮喘氣道重塑治療藥物的一個良好的候選標靶。

1，25-(OH)2D3主要通過與其受體VDR的結合發揮生物學效應。而VDR被認為是NF-κB活性調控的重要上游分子［14－15］。現已發現1，25-(OH)2D3能通過與VDR的配體受體效應來抑制NF-κB信號通路進而調節多種體內外的生物學效應［16－17］。本實驗進一步將1，25-(OH)2D3對NF-κB活性的這種抑制作用擴展到了哮喘肺組織中。結果發現1，25-(OH)2D3能通過增加哮喘肺組織中IκBα的mRNA表達及減少其磷酸化這兩種途徑來上調IκBα的蛋白表達，進而有效地抑制哮喘肺組織中NF-κB p65的核移位，發揮抑制NF-κB活性的作用。

鑒于NF-κB信號通路是哮喘氣道重塑的關鍵環節，有理由認為1，25-(OH)2D3抑制哮喘肺組織中的NF-κB活化可能是其調節哮喘氣道重塑的重要作用機制。當然，NF-κB通路同時也是調控哮喘免疫和氣道炎癥反應的關鍵性調控因子，因此1，25-(OH)2D3對哮喘肺組織NF-κB活化的抑制作用也為其已明確的對哮喘的免疫調節和抗炎作用提供了理論依據。此外，新近流行病學研究發現補充維生素D水平能明顯減輕哮喘嚴重程度并有效改善激素治療反應［18］。而NF-κB持續性過度激活不僅是重度哮喘的重要特征，同時也是影響激素臨床療效的重要原因［19］。故除外已知的1，25-(OH)2D3能提高CD4+T細胞在地塞米松作用下分泌IL-10的能力［13］，本實驗證實的1，25-(OH)2D3抑制哮喘NF-κB活化亦為上述流行病學結果提供了一個可能的合理性解釋。

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