牛磺酸鎂對缺氧/復氧致大鼠心肌細胞內向整流鉀通道異常的影響

何海燕，尹永強，李宏杰，叢恬駪，康 毅，婁建石

(天津醫科大學藥理學教研室，天津 300070)

心律失常(cardiac arrhythmia)是心血管系統疾病常見的臨床表現形式，也是最為嚴重的病癥之一，有較高的發病率和致死率，嚴重威脅人類健康。缺血/再灌注常可引起心肌梗死、心肌細胞凋亡及心律失常。目前，臨床常規使用的抗心律失常藥物療效不突出，有文獻報道抗心律失常藥物總有效率僅為30% ～60%，遠期療效也不甚理想［1-2］。很多藥物雖有一定療效，但有加重或致心律失常的危險［3］。因此，揭示心律失常發生的深層機制，尋找療效確切、無明顯不良反應的抗心律失常藥物成為該研究領域的重點。牛磺酸鎂配合物(taurine magnesium coordination compound，TMCC)是本研究室合成的配合物，既往實驗研究證實該配合物對多種因素誘導的實驗性心律失常與觸發活動有確切的防治效果［4-6］，且其對缺血/再灌注心律失常的治療效果明顯優于單用牛磺酸或鎂離子。細胞水平的研究證明該配合物不僅對正常狀態的鈉、鉀、鈣離子通道有影響［7-8］，而且對藥物誘發的異常鈉電流及異常鈣電流亦有作用［9-11］。提示該配合物可能具有廣泛的抗心律失常作用，但作用機制尚未被充分闡明。內向整流鉀通道Ik1的異常與心律失常的關系深入研究的報道甚少，鑒于Ik1通道特殊的結構和電生理特性，有學者認為Ik1通道與抗心律失常的關系研究意義重大［12］。諸多疾病或病理情況下發生的心律失常與Ik1下降有關，如LQT綜合征、尖端扭轉性室速、心肌缺血性心律失常等。但未見有報道TMCC對Ik1作用的相關文獻，因此，本研究擬建立大鼠心肌細胞的缺氧/復氧模型，觀察TMCC對大鼠心室肌細胞內向整流鉀通道的影響，探討其抗心律失常的電生理及離子通道機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康成年Wistar大鼠，♂，體質量220～250 g，合格證號:SCXK(軍)2009-003。

1.1.2 藥品與試劑 HEPES、EGTA、Mg-ATP、膠原酶Ⅱ等購自Sigma公司。TMCC由天津醫科大學化學教研室合成。

1.1.3 儀器 膜片鉗儀，MultiClamp 700B，USA;數-模轉換器，DigiData1440A，USA;倒置顯微鏡，IX51，Japan;三維操縱儀，MP-225，USA;微電極拉制儀，P-97，USA;恒流泵，Peri-Star，臺灣;酸度計，PHS-3C，上海精密科學儀器有限公司;Millipore純水系統，USA。

1.1.4 液體的制備 無鈣臺式液(mmol·L-1): NaCl 136，KCl 5.4，NaH2PO40.33，MgCl21.0，HEPES 10，Glucose 10;用NaOH調pH至7.45。細胞保存液(KB液，mmol·L-1):L-谷氨酸70，牛磺酸15，KCl 30，KH2PO410，MgCl20.5，HEPES 10，EGTA 0.5，Glucose 10;用KOH調pH至7.4。記錄內向整流鉀電流(Ik1)的細胞外液(mmol·L-1): NaCl 132，CaCl21.8，KC1 4，MgCl21.2，HEPES 10，Glucose 10，CdC120.1;用NaOH調pH至7.4。記錄內向整流鉀電流(Ik1)的缺氧細胞外液:去除Glucose，其余同記錄內向整流鉀電流(Ik1)的細胞外液，通氮氣20 min，用NaOH調pH到6.80。記錄Ik1的電極內液(mmol·L-1):KCl 140，MgCl21，MgATP 4，EGTA 5，HEPES 10;用KOH調pH至7.3。

1.2 方法

1.2.1 單個大鼠心肌細胞的分離 用25%烏拉坦將大鼠麻醉，仰位固定于鼠臺上，迅速剪開胸腔暴露心臟，從主動脈根部離斷取出心臟放入4℃無鈣臺式液中，去除脂肪及結締組織。將主動脈逆行插管連接于Langendorff灌流裝置(恒溫37℃)上，以無鈣臺式液8 ml·min-1連續灌流5 min，洗去心臟殘血后改用50 ml含10mg膠原酶Ⅱ與15 mg牛血清白蛋白的無鈣臺式液進行循環灌流。隨著灌流的進行，流出液變得黏稠，心肌的顏色逐漸變淺、透明，心臟體積逐漸變大、松軟。此時將心臟自左心室分段剪取心肌組織，置于裝有KB液的試管中，用吸管輕輕吹打使之分散成單個細胞，分裝，置4℃冰箱中穩定2 h待用。

1.2.2 內向整流鉀通道電流(Ik1)的記錄 應用全細胞膜片鉗技術記錄單細胞離子電流。所用微電極用兩步拉制儀拉制而成，微電極充電極液后電阻在2～4 MΩ之間。電流信號經MultiClamp 700B膜片鉗 放 大 器、DigiData1440A 數-模 轉 換 器 及Pclamp10.1采集儲存及分析。將細胞懸液置于倒置顯微鏡工作平臺容積為1 ml的浴槽中，待細胞貼壁后，用鉀外液進行灌流，流速1 ml·min-1。選用大小相近、紋理清晰的桿狀細胞進行實驗。待高阻封接后，進行電極電容補償。負壓或高電壓脈沖破膜，進行膜電容、串聯電阻及漏電流補償，平衡5 min，待電極內鉀內液與細胞內液交換充分后，進行膜電流記錄。膜電流的大小以電流密度及單位膜電容的膜電流表示。

1.2.3 實驗分組和造模 實驗分為正常對照組、正常+100 μmol·L-1TMCC組、正常+200 μmol· L-1TMCC組、正常+400 μmol·L-1TMCC組、缺氧/復氧模型組(H/R組)、H/R+24.24 μmol·L-1胺碘酮組、H/R+100 μmol·L-1TMCC組、H/R+ 200 μmol·L-1TMCC組、H/R+400 μmol·L-1TMCC組。將分離的細胞置于浴槽中，待貼壁后，先用記錄內向整流鉀電流(Ik1)的細胞外液進行灌流，封接形成全細胞記錄模式后，平衡5 min，待電極內鉀內液與細胞內液充分交換后，進行膜電流記錄，定義為正常細胞Ik1，正常+TMCC組即在以上條件下加入不同濃度的TMCC進行記錄;然后用缺氧鉀外液沖洗替換浴槽中的正常鉀外液，15 min后再以正常有氧鉀外液沖洗替換缺氧鉀外液，5 min后記錄即為缺氧/復氧組Ik1;H/R+TMCC組和H/R+胺碘酮組分別在有氧鉀外液中加入不同濃度的TMCC和胺碘酮。記錄Ik1時細胞外液中加入CdCl2以阻斷L-鈣電流。形成全細胞構型后，在電壓鉗模式下記錄電流。保持電壓為-50 mV，指令電壓從-100 mV開始，以10 mV步階躍至 -10 mV，脈沖持續300 ms，刺激頻率為0.2 Hz，可記錄到大鼠心肌細胞的Ik1電流。在細胞外液中加入0.l mmol·L-1CdCl2使鈣通道電流失活，鉗制電壓-50 mV以阻斷INa的影響。測定從0時開始到刺激結束時的300 ms電流穩態值，除以該細胞的電容標化為Ik1的電流密度(pA·pF-1)。

1.3 統計學分析 在Clampfit 10.0軟件中將記錄的原始數據進行處理分析，結果以±s表示。根據給藥前后不同電壓水平下的最大激活電流繪制Ik1的I-V曲線。采用SPSS 17.0軟件對資料進行統計分析，單因素方差分析給藥組與對照組間的差異顯著性。

2 結果

2.1 TMCC對正常大鼠心肌細胞Ik1的影響 記錄Ik1電流，保持電壓為-50 mV，指令電壓從-100 mV開始，以10 mV步階躍至 -10 mV，脈沖持續300 ms，刺激頻率為0.2 Hz，可記錄到大鼠心肌細胞的Ik1電流(Fig 1)。在細胞外液中加入0.1 mmol· L-1CdCl2使鈣通道電流失活，鉗制電壓-50 mV以阻斷INa的影響。測定從0時開始到刺激結束時的300 ms電流穩態值，Ik1電流為電流峰值與基線之差，除以該細胞的電容標化為Ik1的電流密度(pA· pF-1)。Ik1內向電流以刺激電壓-100 mV峰值電流密度作為觀察指標，Ik1內向電流以刺激電壓-30 mV峰值電流密度作為觀察指標。正常對照組和各濃度TMCC對正常細胞作用的Ik1電流峰值及I-U曲線變化見Tab 1，Fig 2，實驗結果表明，正常組細胞的Ik1內向及外向電流峰值與正常+TMCC(100、200、400 μmol·L-1)組相比，差異無顯著性(P均 ＞0.05);I-V曲線無明顯變化。不同濃度TMCC對正常大鼠心肌細胞內向整流鉀通道電流沒有作用。

Fig 1 Current of Ik1in rat ventricular myocardiocytes

Tab 1 Effects of TMCC(100，200，400 μmol·L－1) on Ik1current density in normal rat ventricular myocardiocytes(±s，n=6)

Tab 1 Effects of TMCC(100，200，400 μmol·L－1) on Ik1current density in normal rat ventricular myocardiocytes(±s，n=6)

Group Inward current density/pA·pF-1 (-100 mV) Outward current density/pA·pF-1 (-30 mV) Normal -13.05±1.43 2.43±0.32 Normal+100μmol·L-1TMCC -12.98±1.09 2.26±0.23 Normal+200μmol·L-1TMCC -12.77±1.11 2.33±0.55 Normal+400μmol·L-1TMCC -12.71±1.16 2.44±0.21

Fig 2 Effects of TMCC(100，200，400 μmol·L－1)on I-U curves of Ik1in normal rat ventricular myocardiocytes(n=6)

2.2 TMCC和胺碘酮對大鼠心肌細胞缺氧/復氧損傷模型Ik1的影響 記錄Ik1電流，保持電壓為-50 mV，指令電壓從-100 mV開始，以10 mV步階躍至-10 mV，脈沖持續300 ms，刺激頻率為0.2 Hz，可記錄到大鼠心肌細胞的Ik1。在細胞外液中加入0.l mmol·L-1CdCl2可使鈣通道電流失活，鉗制電壓-50 mV以阻斷INa的影響。測定從0時開始到刺激結束時的300 ms電流穩態值，Ik1電流為電流峰值與基線之差，除以該細胞的電容標化為Ik1的電流密度(pA·pF-1)。Ik1內向電流以刺激電壓-100 mV峰值電流密度作為觀察指標，Ik1內向電流以刺激電壓-30 mV峰值電流密度作為觀察指標。胺碘酮及各濃度TMCC對正常細胞作用的Ik1電流峰值及I-V曲線變化見Tab 2，Fig 3，實驗結果表明，缺氧/復氧能使Ik1內向電流峰值從(-13.05±1.43)pA·pF-1降至(-6.94±0.59)pA·pF-1(n=6，P＜0.01)，內向電流曲線上移，使Ik1外向電流峰值從(2.43± 0.32)pA·pF-1降到(1.31±0.28)pA·pF-1，外向電流曲線下移。提示缺氧/復氧損傷引起大鼠心室肌細胞內向整流鉀通道異常，實驗模型制備成功。與缺氧/復氧組相比，TMCC(100、200、400 μmol· L-1)可使減小的內向電流峰值分別恢復為(-7.21 ±0.79)pA·pF-1、(-7.28±0.22)pA·pF-1、(-10.96±0.78)pA·pF-1(n=6，P＜0.01)，24.24 μmol·L-1胺碘酮使其恢復為(-8.80±0.97)pA· pF-1。TMCC(100、200、400 μmol·L-1)和胺碘酮均可使上移的內向電流曲線下移。使減小的外向電流分別恢復為(0.90±0.14)pA·pF-1、(1.84± 0.46)pA·pF-1、(2.36±0.40)pA·pF-1，24.24 μmol·L-1胺碘酮使其恢復為(2.16±0.69)pA· pF-1，TMCC(100、200、400 μmol·L-1)和胺碘酮均可使下移的外向電流曲線上移。翻轉電位均在-50 mV到-60 mV之間，無明顯變化。

Tab 2 Effects of TMCC(100，200，400 μmol·L－1)，amiodarone(24.24 μmol·L－1)on Ik1current density in rat ventricular cardiomyocytes suffered from hypoxia/ reoxygenation(H/R)(±s，n=6)

Tab 2 Effects of TMCC(100，200，400 μmol·L－1)，amiodarone(24.24 μmol·L－1)on Ik1current density in rat ventricular cardiomyocytes suffered from hypoxia/ reoxygenation(H/R)(±s，n=6)

＊＊P＜0.01 vs normal;##P＜0.01 vs H/R;▲P＜0.05▲▲P＜0.01 vs amiodarone;★★P＜0.01 vs 100 μmol·L-1TMCC;▼▼P＜0.01 vs 200 μmol·L-1TMCC

Group Inward current density /pA·pF-1 (-100 mV) Outward current density /pA·pF-1 (-30 mV) Normal -13.05±1.43 2.43±0.32 H/R -6.94±0.59 1.31±0.28 H/R+24.24μmol·L-1 amiodarone -8.80±0.97＊＊## 2.16±0.69## H/R+100μmol·L-1TMCC -7.21±0.79＊＊▲ 0.90±0.14＊＊▲▲H/R+200μmol·L-1TMCC -7.28±0.22＊＊▲ 1.84±0.46★★H/R+400μmol·L-1 TMCC -10.96±0.78＊＊##▲▲★★▼▼ 2.36±0.40##★★

Fig 3 Effects of TMCC(100，200，400 μmol·L－1)and amiodarone(24.24 μmol·L－1)on I-V curves of Ik1 in normal rat ventricular myocardiocytes suffered from hypoxia/reoxygenation(H/R)(n=6)

3 討論

內向整流鉀通道(inward rectifier potassium channel)于1949年由Katz首先在鉀去極化肌細胞中發現，其為一大類鉀離子通道，在各種組織中廣泛分布，其中心肌細胞中主要有 Kir2.1、Kir2.2、Kir2.3，心臟中的內向整流鉀通道主要分布在心房肌和心室肌，其在心肌細胞動作電位的各時相均有開放，但在動作電位3相復極和靜息電位相電導性最大。其在超極化時表現為明顯的內向電流，鉀離子大量內流，膜電位靠近鉀的平衡電位，防止過度超極化［13］，輕度去極化時表現為外向電流，借此維持靜息電位的穩定。當進一步去極化時外向電流反而減小，表現出內向整流特性［14］，主要功能是參與動作電位的3期復極，維持心肌細胞靜息電位的正常水平和正常興奮節律。大量臨床及實驗研究表明，Ik1參與了許多病理性心律失常。Junichiro等［15］在Kir2.1過表達的轉基因小鼠中觀察到多種心律失常，如緩慢心率、室性早搏、房室傳導阻滯和心房顫動(AF)等;相反地，kir2.1抑制性突變體表達的小鼠則表現為Ik1電流的抑制，靜息膜電位正向移動，動作電位時程延長，以及心肌興奮性變化如QRS波及QT間期的延長。心肌缺血和心肌梗死時心律失常發生也與Ik1下降有關。Almond等［16］報道，大鼠心肌梗死區Ik1減小20%。Adeniran等［17］指出Ik1通道異常會引起伴有Andersen’s綜合征、LQT綜合征、SQTS等的心律失常。

本實驗中的缺氧/復氧模型旨在模擬心肌細胞的缺血/再灌注過程，有研究表明組織缺血缺氧時，無氧代謝增強，細胞內乳酸堆積，pH值降低，細胞外的鉀離子濃度升高［18］。再灌注時，發生鈉-鈣離子交換，細胞內鈣超載的同時，細胞外的鈉離子濃度升高，產生大量自由基，進而引起線粒體和細胞內膜性結構的損傷，造成心肌細胞嚴重損傷。Ik1的整流作用減弱，或誘發早期后除極電位，而形成異常心律［19］。另有研究發現肥厚型心肌病及心力衰竭時心肌的Ik1電流密度減小，線粒體功能障礙會導致細胞的pH下降及Kir2.1電流的pH依賴性的上調，從而導致Ik1電流的抑制，部分解釋缺血缺氧時心肌的興奮性異常［20］。這與本實驗Ik1電流變化相符。

本實驗結果顯示缺氧/復氧過程可使大鼠心肌細胞Ik1內向電流和外向電流峰值均減小，動作電位時程增大，復極緩慢，靜息電位減少，復極異常和早后除極改變細胞興奮性易引起心律失常。TMCC可恢復Ik1電流異常，從而抑制因缺氧/復氧誘發的Ik1電流變化，使其恢復至正常水平，其作用與胺碘酮相當。這一結果提示，TMCC對缺氧/復氧造成的快速性心律失常有治療作用。此外，本實驗結果中TMCC(100、200、400 μmol·L-1)對正常心肌細胞Ik1無影響，但可部分恢復缺氧/復氧減小的Ik1值，表明TMCC對心肌細胞Ik1的作用與該通道的狀態有關，可使異常的電流趨向恢復正常。TMCC對正常Ik1無明顯影響，提示該化合物不易出現因對單個通道作用過強而導致心律失常等副作用。

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