穿透性Sox2蛋白的質粒構建及功能鑒定

丁道芳，王 瑧，李曉鋒，徐樂勤，梁倩倩，王擁軍

(1.上海中醫藥大學龍華醫院脊柱病研究所，上海 200032;2.復旦大學腫瘤醫院中心實驗室，上海 200433)

誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPS cells)最初由日本科學家于2006年利用病毒載體將Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc 4個轉錄因子的組合轉入體細胞中，使其重編程而得到的類似胚胎干細胞的一種細胞［1］。進一步的研究發現轉錄因子Sox2和Oct4是誘導iPS細胞生成的必要的轉錄因子［2］。

iPS細胞將有希望成為病人治療用靶細胞來源，因此其安全性成為首要關注問題，其次效率也是目前研究的重點之一。目前獲得iPS細胞大多采用病毒的方式，此種方法可以有效的得到iPS細胞，但同時由于病毒的引入增加致癌的風險。在此基礎上，出現修飾性Sox2和Oct4蛋白，即在Sox2等基因的C末端加9～11個精氨酸肽，再將這些蛋白純化或者細胞的裂解物加入到細胞培養基中，這些已經修飾后的蛋白肽可以直接進入細胞，從而將這些體細胞轉變成iPS細胞［3－4］。蛋白轉導的方式可以規避這些風險，但這些蛋白的活性及效率也將成為問題，亟待解決。在本研究中，采用了目前最高效的蛋白表達載體和真核細胞表達方式，使表達的蛋白量增加，并對表達出的蛋白進行通透和促增殖的功能進行鑒定，以確定得到的Sox2通透性蛋白具有活性。本文以Sox2基因為例，研究通透性蛋白的表達和功能鑒定，為進一步得到安全的iPS細胞奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblasts，MEFs)取自懷孕13 d左右孕鼠的胚胎，培養于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基中，本實驗所用細胞均為3代內。293T細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基中。

1.2 主要儀器、試劑 核酸蛋白凝膠成像系統(天能公司)，熒光倒置顯微鏡(Olympus公司)，蛋白電泳和轉膜系統(Biorad公司)。DNA markerⅢ(天根生物公司)，Sox2抗體(Santacruz，美國)，PCNA(Proteintech公司)，GAPDH抗體(CST公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 構建重組質粒pPYCAG-9R-Sox2 通過PCR方法在Sox2基因(實驗室保存)的N端加上9個精氨酸的多肽。9R-Sox2擴增用的引物，上游序列為5'CCG AGATCT ATG CGC AGA CGC CGC AGA CGC AGA CGC CGC TAT AAC ATG ATG GAG3'，下游序列為5'AAT CTC GAG TCA CAT GTG CGA CAG GGG CAG3'。擴增后的基因序列通過亞克隆至pPYCAG載體上。在9R-Sox2融合基因的N端和C端分別引入BglII和XhoI酶切位點，經酶切后連接至經同樣酶切的pPYCAG載體上。

1.3.2 細胞轉染和陽性克隆篩選 pPYCAG-9RSox2重組質粒4 μg和10 μl脂質體2 000分別稀釋于100 μl無血清DMEM培養基中，5 min后兩者混勻，加入293T細胞中，4 h細胞換液，培養于含10% FBS的DMEM中。由于pPYCAG載體攜帶嘌呤霉素抗性基因，具有嘌呤霉素抗性，根據這一特性殺死未轉染pPYCAG-9R-Sox2重組質粒的細胞。轉染72 h后，加嘌呤霉素2 mg·L－1維持至1周。得到表達9R-Sox2的陽性克隆細胞。對照為pPYCAG轉染的293T細胞。

1.3.3 細胞免疫熒光鑒定蛋白表達 表達9RSox2的陽性克隆細胞，PBS清洗兩次，4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS漂洗3次，用5%BSA的封閉液(含0.2%Trition X-100)室溫封閉1 h后，加入羊來源的Sox2抗體(1∶200)，37℃作用2 h，PBS漂洗3次，每次5 min，加入FITC標記的抗山羊二抗(1∶200)，避光37℃反應1 h，PBS漂洗3次，每次5 min，接著用DAPI染色，室溫5 min，PBS漂洗，熒光顯微鏡觀察拍照。對照為轉染空質粒pPYCAG的293T細胞。

1.3.4 細胞蛋白提取 收集表達9R-Sox2的陽性細胞，重懸于裂解液(100 mmol·L－1HEPES，pH 8.2，50 mmol·L－1NaCl，5 mmol·L－1MgCl2，1 mmol·L－1DTT，蛋白酶抑制劑)，直徑10 cm培養皿，細胞長滿加300 μl裂解液，冰上放置30 min，超聲裂解，裂解液于4℃，15 000×g離心15 min。取上清液分裝，于－80℃冰箱放置備用。同時提取轉染空質粒pPYCAG的293T細胞的蛋白，作為后續試驗的對照。

1.3.5 Western blot 12%的聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白，以100V恒壓電泳2 h。經200 mA恒流壓轉膜2 h，轉移目的蛋白至PVDF膜(美國Millipore公司)，用含5%BSA室溫封閉1 h。用封閉液稀釋一抗至適當濃度，4℃孵育過夜。一抗分別為兔抗PCNA(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)。TBST洗膜3次之后，用紅外標記的相應二抗室溫孵育2 h。TBST洗膜3次之后，用紅外標記的相應二抗室溫孵育2 h。TBST洗膜3次，于Odyssey儀器上掃描和分析結果。

2 結果

2.1 PCR擴增9R-Sox2基因及構建Ppycag-9RSox2重組子 PCR擴增9R-Sox2基因，長度為987 bp，如Fig 1A。Ppycag-9R-Sox2轉化入大腸桿菌中擴增并抽提質粒，挑選4個細菌克隆抽質粒后，酶切鑒定表明9R-Sox2已連接至pPYCAG載體上，如Fig 1B。

Fig 1 Construction of recombinant plasmid pPYCAG-9R-Sox2

2.2 表達9R-Sox2融合蛋白的陽性細胞克隆篩選和鑒定 pPYCAG-9R-Sox2轉染至293T細胞中，經2 mg·L－1嘌呤霉素篩選1周，細胞免疫熒光鑒定細胞9R-Sox2蛋白表達，所有的細胞核均標記為綠色，說明表達9R-Sox2蛋白(Fig 2A)，DAPI標記細胞核為藍色熒光(Fig 2B)，Fig A和Fig B融合后，發生重疊(Fig 2C)，表明9R-Sox2表達在所有的細胞核，盡管Sox2前面加了9R短肽，但仍未改變其轉錄因子的特性。在對照細胞中未見有Sox2表達(Fig 2A'，2B'和2A'B')。

Fig 2 9R-Sox2 expression in 293T cells

2.3 9R-Sox2細胞通透和對成纖維細胞促增殖效應 小鼠成纖維細胞分為兩組，分別棄去小鼠成纖維細胞培養基，加入含9R-Sox2細胞裂解液和轉染空質粒的細胞裂解液，37℃培養箱放置1 h，PBS清洗3次以上，一組細胞用于細胞免疫熒光檢測，一組細胞加入培養基繼續培養，48 h后檢測PCNA的表達量。細胞免疫熒光檢測結果顯示，9R-Sox2已定位于小鼠成纖維細胞核(Fig 3A，3B，3AB)，表明9RSox2已穿透細胞細胞膜進入核內，對照組未見Sox2表達(Fig 3A'，3B'，3A'B')。Western blot結果顯示，細胞經含9R-Sox2裂解物處理后，PCNA相對于對照組表達明顯上調。

3 討論

目前對于體細胞重編程成iPS細胞，重編程的效率成為首要需解決的問題。解決措施主要有添加TGF-β、MEK和GSK3信號通路抑制劑和Wnt/βcatenin激活劑而達到提高重編程的效率［5－8］，但仍通過病毒的方式得到iPS細胞，安全性成為主要問題。近年來采用蛋白重編程代替病毒轉導的方式，即表達具有穿透性的蛋白，加入成纖維細胞的培養基中，這些蛋白可直接進入細胞，經過重編程獲得安全可靠的iPS細胞。在這些研究中，已有原核細胞表達重組蛋白，但由于蛋白表達存在翻譯后修飾，此過程影響蛋白的活性和其生物學功能，蛋白的活性影響到其功能的發揮，也影響到重編程的效率。在此基礎上，采用真核表達的方式得到活性高的表達蛋白，但由于表達系統的低效，蛋白表達量也會影響重編程的效率。因此，當重編程提高時，iPS細胞的安全性存在問題;而當安全性問題解決時，重編程的效率被降低。針對這些存在的問題，在本課題的研究中，采用目前最高效的蛋白表達系統表達通透性的蛋白并對其功能進行鑒定。

Fig 3 The cell-penetrated function of 9R-Sox2 and its proliferative effect on MEFs

由于Sox2蛋白轉錄因子活性特點，可表達并定位于細胞核中，而純化的Sox2蛋白即使加入細胞培養基中，也不會穿透細胞膜進入細胞核中發揮作用。通過多聚酶鏈反應(PCR)擴增小鼠的Sox2基因，同時在其N端融合了9個精氨酸短肽，可以自由穿過細胞膜，使其具備細胞穿透功能［9］。擴增后的9RSox2基因克隆至高效表達載體pPYCAG上，此載體具有如下特點:最強的融合啟動子;在含大T抗原的細胞中如293T細胞，隨著細胞的分裂，此表達載體不斷的復制，從而實現最高效的表達。

重組質粒pPYCAG-Sox2轉染至293T細胞中，為進一步保證所有細胞表達9R-Sox2蛋白，細胞轉染后進行抗性基因篩選，進一步使蛋白表達量提高。除了蛋白表達量影響細胞重編程效率，蛋白的活性也是重要因素之一。對表達9R-Sox2蛋白的細胞裂解，得到的蛋白混合物，對其進行活性和功能的檢測，加入至成纖維細胞中，作用1 h后換液，再進行細胞免疫熒光鑒定，和對照細胞相比，經過9R-Sox2蛋白的混合物處理的成纖維細胞在細胞核位置有Sox2蛋白存在，表明9R-Sox2蛋白具備穿透功能。Sox2為細胞轉錄因子，對細胞的增殖有促進作用［10］，對蛋白混合物處理48 h后的細胞進行增殖的檢測。增殖細胞核抗原(PCNA)僅在增殖的細胞中合成和表達，可作為細胞增殖的可靠的評價指標［11－12］。PCNA在含9R-Sox2蛋白混合物組表達明顯上調，進一步說明9R-Sox2進入細胞內發揮功能。

本研究在提高蛋白表達量的同時，也驗證了表達的蛋白具備細胞通透及促進靶細胞增殖的功能，為深入研究蛋白重編程提供依據及細胞學基礎。

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