革皮氏海參總皂苷的安全性評價研究

王 青，王靜鳳，石 迪，徐雷雷，王玉明，薛長湖

(中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島 266003)

海參皂苷(holothurian glycosides)，又稱海參素(holothurin)，在鮮品中含量為0.019% ～0.9%，在干品中為0.341%～1.082%。目前已從30多種海參體內分離出100多種海參皂苷類成分，它是海參的主要次生代謝產物，多數為羊毛甾烷型三萜皂苷，具有提高免疫力［1］、抗真菌［2］、保護肝損傷［3］、抗腫瘤［4－6］等廣泛的藥理活性。革皮氏海參(Pearsonothuria graeffei)屬海參綱(Holothurioider)楯手目(Aspidochirotida)海參科(Holothuriidae)皮氏海參屬(Pearsonothuria)，主要分布在熱帶海域，是一種皂苷含量較高的低值食用海參，其體壁中的皂苷含量較其它海參品種高［1］，可以作為海參皂苷的良好來源。隨著多種海參皂苷逐漸被發現，其生物活性也受到越來越多的關注。但無論是海參皂苷還是其它的皂苷，都是強的表面活性劑，對各種動植物細胞具有廣泛的毒性［7－8］，如大多數海參皂苷都具有較強的溶血活性［8］，研究還發現，與海參皂苷同屬三萜類化合物的植物性皂苷對機體具有不同程度的毒性作用，其毒性作用主要以肝、腎損傷為主［9］。近年來有關海參皂苷安全性評價的研究尚未見報道。本研究以革皮式海參總皂苷為研究對象，從急性毒性實驗、骨髓細胞微核實驗和30d喂養實驗3個方面對海參皂苷進行毒理學安全性評價，以期為海參皂苷的開發應用和低值海參的高值化加工利用及深度開發提供理論依據。

1 材料

1.1 海參及實驗動物 革皮氏海參，購于青島南山市場，并經中國科學院海洋研究所廖玉麟研究員鑒定。健康ICR小鼠，♀♂各半，體質量為18～20 g，4周齡，SPF級;健康Wistar大鼠，♀♂各半，體質量為90～110 g，SPF級，均購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物合格證號為SCXK(京)2007－0001。實驗期間動物房環境溫度為22℃ ～24℃，濕度為52%～58%。

1.2 主要試劑 葡萄糖試劑盒(批號:20110716)，中生北控生物科技有限公司產品;白蛋白試劑盒(批號:20110720)、總蛋白試劑盒 (批號: 20110725)、乳酸脫氫酶試劑盒(批號:20110706)、肌酸激酶試劑盒(批號:20110706)、肌酐試劑盒(批號:20110720)、尿素氮試劑盒(批號:20110720)、尿酸試劑盒(批號:20110720)、谷草轉氨酶試劑盒(批號:20110716)、谷丙轉氨酶試劑盒 (批號: 20110716)、總膽固醇試劑盒(批號:20110725)、甘油三酯試劑盒(批號:20110725)，均為南京建成科技有限公司產品;Giemsa染料，上海勁馬生物科技有限公司產品。其它試劑均為國產分析純。

1.3 主要儀器 酶標儀(680型，美國Bio-Rad公司);高速冷凍離心機(GL-20M型，上海盧湘離心機儀器有限公司);全自動血細胞分析儀(XT1800i型，日本Sysmex公司);臺式離心機(TGL-16G型，上海安亭科學儀器廠)，光學顯微鏡(BH-2型，日本O-lympus公司)。

2 方法

2.1 革皮氏海參總皂苷的制備 用粉碎機將革皮氏海參干品粉碎，加60%乙醇熱回流抽提6次，合并各次抽提所得上清液，減壓回收乙醇，得水溶液，過HP-20型大孔樹脂柱，依次以水、80%乙醇及100%乙醇洗脫，收集80%乙醇洗脫液減壓濃縮，經真空冷凍干燥后得到革皮氏海參總皂苷。采用香草醛―冰乙酸比色法［10］測定，所得革皮氏海參總皂苷的純度為65%。將其于常溫下干燥保存，臨用時用0.5%羧甲基纖維素配調。

2.2 急性毒性實驗 根據預實驗的結果，將健康ICR小鼠隨機分為正常組和革皮氏海參總皂苷不同劑量組，每組5只。實驗前禁食不禁水12 h后，劑量組小鼠分別一次性灌胃不同濃度革皮氏海參總皂苷溶液(分別為0.464、1、2.15和 4.64 g·kg－1bw)，正常組灌胃0.5%羧甲基纖維素溶液，灌胃體積為0.01 ml·g－1bw。灌胃后連續觀察14 d，記錄死亡數，按照概率單位法［11－12］測定海參皂苷LD50及95%可信區間。

2.3 骨髓細胞微核實驗 健康ICR小鼠，♂♀各半，適應性喂養3 d后，隨機分為正常對照組，陽性對照組，皂苷低、中、高劑量組，每組5只。陽性對照組灌胃環磷酰胺(40 mg·kg－1)，各劑量組灌胃不同濃度的海參皂苷溶液(♀分別為138、275和550 mg·kg－1，♂分別為135、270和540 mg·kg－1)，正常對照組灌胃等體積的0.5%羧甲基纖維素溶液，灌胃體積為0.01 ml·g－1bw。用30 h給受試物法［13］，即第1次灌胃后間隔24 h進行第2次灌胃，第2次給受試物后6 h，脫頸椎處死動物。取股骨制作骨髓細胞涂片，經甲醇固定、Giemsa溶液染色后，檢查計數有微核的PCE，微核率以千分率表示，并計數200個細胞中PCE與成熟紅細胞(NCE)的比值。

2.4 30 d喂養實驗 健康Wistar大鼠，4周齡，♂♀各半，適應性喂養3 d后，隨機分為正常組，革皮氏海參總皂苷低、中、高劑量組，每組10只。各劑量組分別灌胃不同濃度的革皮氏海參總皂苷溶液(劑量分別為25、50和100 mg·kg－1bw，分別為半數致死量的3.25%、6.5%和13%)，正常組灌胃0.5%羧甲基纖維素溶液。灌胃體積為0.01 ml·g－1bw，每天1次，連續30 d。每天觀察和記錄大鼠的活動和攝食情況;每3天稱一次體重;實驗結束前4 d，大鼠單只入代謝籠收集24 h尿液，并記錄尿液體積，取5 ml尿液離心后取上清，用于尿液中相關生化指標的檢測;實驗結束前1 d，大鼠尾靜脈取血，檢測外周血像各指標;于末次給藥后，禁食不禁水12 h，大鼠經乙醚麻醉，腹主動脈取血，7 500 r·min－1離心15 min，分離血清，用于血清生化指標的檢測;仔細剝離心、肝、胃、肺、腎、睪丸、卵巢等器官，經10%甲醛固定、石蠟包埋、切片和HE染色，進行組織病理學觀察。

2.3.1 外周血像的檢測 采用全自動血細胞分析儀，檢測血液中白細胞(white blood cell，WBC)、紅細胞(red blood cell，RBC)、血小板(platelets，PLT)數量和血紅蛋白(hemoglobin，Hb)含量。

2.3.2 血糖和血脂的檢測 參照試劑盒分別測定血糖和血清中總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)的含量。

2.3.3 肝臟功能指標的檢測 參照試劑盒分別檢測血清中谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、谷丙轉氨酶(alanine transaminase，ALT)、白蛋白(albumin，ALB)和總蛋白(total protein，TP)的含量。

2.3.4 心肌損傷指標的檢測 參照試劑盒分別檢測血清中乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)和肌酸激酶(creatine kinase，CK)的含量。

2.3.5 腎臟功能指標的檢測 參照試劑盒分別測定血清和尿液中尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(creatinine，Cr)和尿酸(uric acid，UA)的含量。

2.4 統計學分析 數據分析采用SPSS 11.0軟件進行單因素方差分析，并以LSD法進行兩兩比較。

3 結果與討論

3.1 急性毒性實驗 急性毒性實驗是毒理學安全性評價第一階段最基礎的實驗，據此可了解受試物對機體造成急性損害的可能性、嚴重程度及毒性性質。實驗過程中，給予灌胃2.15、4.64 g·kg－1bw革皮氏海參總皂苷的小鼠和1、0.464 g·kg－1bw革皮氏海參總皂苷的個別小鼠，變得安靜，活動減少，個別出現抽搐現象，最終呼吸變弱直至死亡。存活小鼠在活動、攝食、飲水等發面均正常，實驗結束解剖動物，大體觀察肝、腎、脾、心、肺等主要臟器均未見明顯異常改變，不同劑量組小鼠的死亡數見Tab 1，根據概率單位法計算，革皮氏海參總皂苷對♀和♂小鼠的LD50分別為1.10和1.08 g·kg－1，根據《保健食品檢驗與評價技術規范(2003年版)》中的急性毒性分級標準，屬低毒級。

3.2 骨髓細胞微核實驗 結果見Fig 1和Tab 2。與正常對照組相比，陽性對照組小鼠微核率差異有顯著性;海參皂苷各劑量組的微核率與正常對照組比較，差異均無顯著性。提示革皮式海參總皂苷對小鼠骨髓細胞微核發生沒有誘導作用。

3.3 大鼠30 d喂養實驗

3.3.1 大鼠一般狀況觀察 灌胃革皮氏海參總皂苷30 d，劑量組大鼠精神活躍，運動性強，毛色光澤，飲食、飲水均正常，與正常組相比較沒有明顯差異。實驗期間大鼠均無死亡或異?，F象。

3.3.2 對大鼠體重的影響 結果見Tab 2。在整個實驗期間，正常對照組♀♂大鼠體重穩步增加;灌胃海參皂苷后，劑量組大鼠體重變化同正常組無差異。表明海參皂苷對大鼠體重無明顯影響。

3.3.3 對大鼠外周血像的影響 結果見Tab 3。與正常組相比，劑量組大鼠血液中WBC、RBC、PCT數量和Hb含量差異均無顯著性(P＞0.05)。說明革皮氏海參總皂苷對大鼠外周血中各常規指標無影響。

3.3.4 對大鼠血糖和血脂的影響 TG和TC是反應機體脂質代謝的重要指標。與正常組相比較，劑量組血糖、TC和TG差異均無顯著性(結果見Tab 4)。提示革皮氏海參總皂苷對大鼠糖代謝和脂代謝沒有影響。

3.3.5 對大鼠肝臟功能的影響 AST和ALT是肝臟功能檢測的主要指標，主要反映肝細胞有無受損及嚴重的程度，當肝臟損傷時，血液中AST和ALT會升高［14］;ALB、TP主要是反映肝細胞蛋白合成代謝功能的指標，當肝功能障礙時，肝臟合成蛋白質含量會減少。由表5可見，與正常組相比，劑量組血清中AST、ALT、ALB和TP含量差異均無顯著性(P＞0.05)。提示革皮氏海參總皂苷對大鼠肝臟功能沒有產生明顯的毒性作用。

Tab 1 LD50of P.graeffei in mice(n=5)

Tab 2 Results of micronucleus tests of bone marrow PCE cells in mice(n=10)

Tab 3 Effects of saponins of P.graeffei on peripheral hemogram in rats(±s，n=10)

Tab 3 Effects of saponins of P.graeffei on peripheral hemogram in rats(±s，n=10)

Sex Dose/mg·kg－1 WBC/109·L－1 RBC/1012·L－1 PLT109·L－1 Hb/g·L －1 Male 0 9.63±2.45 7.85±0.47 964.33±55.34 160.50±12.30 20 10.10±1.68 7.69±0.67 986.00±65.05 163.70±16.40 50 9.70±1.47 7.85±0.97 966.67±65.72 163.40±18.20 100 9.90±0.60 7.88±0.95 954.50±55.67 164.50±16.90 Female 0 9.23±2.74 7.17±0.77 929.50±83.37 162.50±13.40 20 9.94±1.94 7.43±0.44 971.20±32.18 163.30±31.20 50 9.58±2.39 7.18±0.42 938.50±83.05 161.60±24.20 100 9.66±2.85 7.46±0.28 916.00±23.37 163.50±30.80

Fig 1 Morphologic observation of bone marrow PCE cells in mice

3.3.6 對大鼠心肌損傷的影響 LDH和CK是心肌胞質中的特異性酶，其外漏的程度可間接反映心肌的受損程度［15］。由Tab 6可知，與正常組相比，各劑量組血清中LDH、CK含量差異無顯著性(P＞0.05)。提示革皮氏海參總皂苷對大鼠心肌沒有產生毒性作用。

Tab 4 Effects of saponins of P.graeffei on blood glucose and lipids in rats(±s，n=10)

Tab 4 Effects of saponins of P.graeffei on blood glucose and lipids in rats(±s，n=10)

Sex Dose/ mg·kg－1 Blood glucose/ mg·L－1 TC/ mmol·L－1 TG/ mmol·L －1 Male 0 7.50±1.80 1.72±0.19 0.24±0.10 20 7.77±1.06 1.66±0.06 0.26±0.02 50 7.64±1.42 1.68±0.21 0.26±0.05 100 7.60±0.24 1.68±0.32 0.24±0.16 Female 0 7.78±1.18 1.79±0.15 0.24±0.14 20 7.81±1.27 1.79±0.07 0.25±0.04 50 7.72±0.99 1.76±0.20 0.26±0.11 100 7.82±0.82 1.77±0.31 0.25±0.01

3.3.7 對大鼠腎臟功能的影響 BUN、Cr和UA分別為人體蛋白質、肌酸和嘌呤代謝產物，3種物質均經腎小球濾過而隨尿液排除體外［16］，是判斷腎功能損害程度的重要指標。當腎實質受損害時，腎小球濾過率降低，血清中UA、Cr和BUN含量會升高。從Tab 7看出，與正常組相比，劑量組血清和尿液中Cr、UA、BUN的含量差異均無顯著性(P＞0.05)。提示革皮氏海參總皂苷對大鼠腎臟沒有產生明顯毒性作用。

Fig 2 Effects of saponins of P.graeffei on the body weight in rats

Tab 5 Effects of saponins of P.graeffei on liver function in rats(±s，n=10)

Tab 5 Effects of saponins of P.graeffei on liver function in rats(±s，n=10)

Sex Dose/mg·kg－1 AST/mmol·L－1 ALT/mmol·L－1 ALB/mmol·L－1 TP/mmol·L －1 Male 0 73.13±15.03 25.04±7.42 33.86±2.10 0.72±0.03 20 75.37±1.29 24.70±4.54 33.38±3.74 0.73±0.02 50 75.23±14.73 26.66±4.80 33.96±3.50 0.73±0.03 100 74.79±5.40 25.81±4.91 33.49±2.87 0.73±0.05 Female 0 68.26±5.60 25.44±5.98 33.13±2.67 0.73±0.02 20 69.03±5.46 25.61±7.88 34.73±1.44 0.73±0.03 50 70.51±12.79 26.17±2.05 34.58±0.55 0.72±0.04 100 69.12±4.72 26.56±7.35 33.75±3.43 0.72±0.05

Fig 3 Effects of saponins of P.graeffei on histomorphology in rats

3.3.8 組織病理學檢查 對各劑量組大鼠肝、腎、睪丸、卵巢、胃、心、肺等臟器肉眼觀察的結果表明，與正常對照組比較，各臟器的顏色和大小正常，均未見明顯滲出、水腫、增生、萎縮等病變。顯微觀察結果顯示，與正常對照組比較，高劑量組大鼠睪丸曲細精管排列不規則，直徑有所變大，出現不規則變形，生精上皮層次減少，間隙增寬，支持細胞減少，說明灌胃高劑量的革皮氏海參總皂苷對大鼠睪丸有輕微損傷，其它臟器結構均未發現明顯異常改變。

Tab 6 Effects of saponins of P.graeffei on myocardial function in rats(±s，n=10)

Tab 6 Effects of saponins of P.graeffei on myocardial function in rats(±s，n=10)

Sex Dose/mg·kg－1 LDH/U·L－1 CK/U·L －1 Male 0 3.29±2.32 0.43±0.07 20 3.27±1.02 0.42±0.09 50 3.32±2.26 0.42±0.12 100 3.36±0.37 0.43±0.12 Female 0 3.43±1.12 0.43±0.07 20 3.31±2.22 0.43±0.10 50 3.43±1.23 0.44±0.10 100 3.37±1.12 0.44±0.12

Tab 7 Effects of saponins of P.graeffei on the contents of Cr，UA and BUN of serum in rats(±s，n=10)

Tab 7 Effects of saponins of P.graeffei on the contents of Cr，UA and BUN of serum in rats(±s，n=10)

Sex Dose/mg·kg－1UA/mg·L－1 BUN/mmol·L－1Cr/mmol·L －1 Male 0 87.80±12.14 7.48±1.08 90.70±16.70 20 87.17±17.81 7.61±1.10 89.50±17.78 50 88.27±14.94 7.43±0.55 88.67±15.85 100 89.63±15.28 7.51±1.00 89.67±14.50 Female 0 88.20±10.62 7.51±0.97 90.56±22.32 20 86.60±15.22 7.67±1.24 91.28±14.53 50 87.33±16.92 7.48±0.88 89.33±12.20 100 88.90±16.75 7.41±0.44 88.29±15.78

Tab 8 Effects of saponins of P.graeffei on the levels of UA，BUN and Cr of urine in rats(±s，n=10)

Tab 8 Effects of saponins of P.graeffei on the levels of UA，BUN and Cr of urine in rats(±s，n=10)

Sex Dose/mg·kg－1UA/mg·L－1 BUN/mmol·L－1Cr/mmol·L －1 Male 0 30.50±5.80 29.77±5.00 311.00±34.66 20 30.17±4.06 28.76±5.59 308.60±48.80 50 31.67±6.42 28.91±3.75 306.20±82.79 100 30.17±3.24 28.61±7.81 304.67±79.50 Female 0 30.71±8.28 28.63±2.64 314.50±54.73 20 30.25±3.27 28.94±8.33 308.20±55.57 50 31.33±5.99 28.43±6.91 307.20±68.73 100 29.17±6.82 27.39±3.46 305.20±52.06

睪丸是機體的生殖和內分泌器官，革皮式海參總皂苷對大鼠睪丸產生毒性作用，可能導致精子存活量下降，畸形率增加，最終造成生殖功能障礙。盡管己知睪丸內有大量毒物可能作用的位點，但對毒物引起睪丸損傷的機制卻知之甚少［17］。越來越多的證據顯示無論是自發的(正常精子發生過程中的)還是由各種刺激引發的生精細胞死亡中，凋亡占據主導地位［18］。細胞凋亡的調節取決于特異性的凋亡前和抗凋亡基因產物，Bcl-2(Bax)家族成員是一組被公認的凋亡調控因子，它們在細胞凋亡途徑中構成一個中央樞紐。此外，研究顯示Fas系統也是哺乳動物睪丸生精細胞凋亡的關鍵調節者［18］。革皮式海參引起的睪丸毒性作用機制有待進一步研究。

根據本實驗的研究，革皮氏海參總皂苷對♀和♂小鼠的LD50分別為1.10和1.08 g·kg－1，屬低毒級;對小鼠骨髓細胞微核發生沒有誘導作用;30 d喂養實驗，劑量組對大鼠的體重、外周血像、肝功能、心肌損傷、腎功能無明顯毒性作用，但對大鼠睪丸有輕微毒性作用，說明其靶器官為睪丸。海參皂苷作為重要的海洋生物活性物質逐漸成為研究的重點，本實驗通過對革皮氏海參總皂苷進行比較系統的安全性評價，為海參皂苷的應用提供劑量參考。

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