miR-96在人乳腺癌中表達及其對乳腺癌細胞侵襲和遷移活性的影響

吳正升，吳 強

(安徽醫科大學病理學教研室，安徽合肥 230032)

近年來，雖然乳腺癌的診療技術和手段有了一定的發展，但是乳腺癌的侵襲性生長和轉移仍是導致患者死亡的重要原因之一。研究發現微小RNA (miRNA)可通過調控靶基因的表達，在乳腺上皮細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲和轉移等過程中發揮重要作用［1－3］。本課題組前期通過miRNA芯片篩查了不同侵襲活性的人乳腺上皮細胞;通過比較其miRNA表達譜，發現多種差異性表達的miRNA，提示這些miRNA可能參與了細胞侵襲活性的調控［4－5］。miR-96是其中具有顯著差異性表達的miRNA之一。為此，本研究通過實時定量PCR驗證miRNA芯片中miR-96的表達結果;并以乳腺癌細胞株MCF-7為模型，通過miRNA抑制物轉染技術，分析下調miR-96表達對乳腺癌細胞增殖、侵襲和遷移活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺上皮細胞系HBL-100、人乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-468均購自美國典藏細胞庫(ATCC);收集安徽醫科大學第一附屬醫院2009年7月至2010年6月間乳腺病例28例，其中乳腺癌17例，乳腺良性病變［纖維腺瘤和(或)腺病］11例，患者均為女性，所有患者術前未做化療、免疫或放射等抗腫瘤治療。所有新鮮組織切除后快速置于液氮速凍后儲存于－70℃。

1.2 試劑 RPMI 1640培養基、L15培養基和DMEM高糖培養基購自美國Corning公司;胎牛血清購自美國Hyclone公司;脂質體轉染試劑購自美國Invitrogen公司;miRNA提取試劑盒和miR-96熒光定量PCR檢測試劑盒均購自美國Ambion公司; miR-96抑制物和陰性對照購自上海吉瑪制藥技術有限公司;MTS細胞增殖檢測試劑盒購自美國Promega;侵襲小室購自美國Corning公司;基質膠購自美國BD公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養、細胞株和新鮮組織中miR-96表達的檢測 HBL-100細胞培養于DMEM培養基中，MCF-7細胞培養于RPMI 1640培養基中、MDA-MB-231和MDA-MB-468培養于L15培養基中，均添加體積分數為10%胎牛血清。10 cm細胞培養皿隔日傳代擴增HBL-100、MCF-7、MDA-MB-231和MDAMB-468細胞，待細胞狀態良好，近90%融合時，以預冷PBS沖洗3次終止培養，冰上用刮棒刮取細胞、移入離心管，4℃、8 000 r·min－1離心10 min，去上清，收集細胞，備用;取乳腺新鮮組織100 mg，置于液氮預冷處理的研缽中，固化、研碎，備用。按照miRNA提取試劑盒說明，分別抽提4株細胞系和乳腺新鮮組織中總miRNA。按照Ambion公司的mir-VanaTMqRT-PCR miRNA檢測試劑盒說明，首先對各個細胞系和新鮮組織總miRNA進行逆轉錄，然后在實時定量PCR儀上進行PCR擴增，使用U6作為內參。

1.3.2 miR-96抑制物(ASO)的轉染 將乳腺癌細胞MCF-7細胞接種后24 h，待貼壁細胞達到30%～50%時進行轉染，參照脂質體轉染試劑說明書分別轉染miR-96 ASO和陰性對照(NC)。

1.3.3 細胞增殖活性的檢測 取轉染36 h后分別miR-96 ASO組和NC組MCF-7細胞，按照MTS細胞增殖檢測試劑盒說明，分別于接種96孔板后24、48、72和96 h各檢測1次。每組設6個復孔。實驗重復3次。

1.3.4 細胞侵襲和遷移活性的檢測 取轉染48 h后miR-96 ASO組和NC組MCF-7細胞，在Transwell小室接種細胞前1 d，在小室底部膜的上室面鋪基質膠(遷移實驗不加基質膠)，按照Transwell小室說明，將侵襲小室下室加入含10%FBS RPMI 1640培養基，將侵襲小室上室加入各組細胞懸液。將侵襲小室置于37℃5%CO2培養箱培養24～48 h，倒置顯微鏡下觀察侵襲小室下室，待少量細胞穿出后中止實驗。用棉簽擦去基質膠和上室內細胞，4%多聚甲醛固定，0.25%考馬斯亮藍染色。正置顯微鏡下進行觀察拍照，采用5個視野進行細胞計數，取平均值進行統計學分析。

2 結果

2.1 乳腺上皮細胞系和臨床乳腺病變組織中miR-96表達 本課題組前期使用miRNA芯片檢測了4種人乳腺細胞系HBL-100、MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-468的miRNA表達譜，結果顯示高侵襲細胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468中miR-96表達較低侵襲HBL-100和MCF-7細胞明顯下調(Fig 1)。為了驗證芯片的結果，本研究中首先使用實時熒光定量PCR方法檢測了這4株細胞miR-96表達。如Fig 1所示，實時熒光定量PCR結果與芯片結果一致，即MDA-MB-231和MDA-MB-468中miR-96表達均較HBL-100和MCF-7細胞明顯下調(P＜0.01)。進一步，如Fig 2所示:在臨床乳腺病變樣本中，17例新鮮乳腺癌組織miR-96表達也較11例乳腺良性病變組織明顯下調(P＜0.01)。

Fig 1 Relative expression of miR-96 in breast cell lines

2.2 miR-96對乳腺癌細胞MCF-7增殖活性的影響 將MCF-7細胞分別轉染miR-96 ASO和NC，使用MTS法檢測這兩組細胞在不同時間點的增殖活性，結果發現miR-96 ASO組與NC組相比，各個時間點細胞的增殖活性差異均無統計學意義(均P＞0.05)。

Fig 2 Relative expression of miR-96 in breast tissue specimens of breast benign disease and breast cancer

2.3 miR-96對乳腺癌細胞MCF-7侵襲和遷移活性的影響 使用 Transwell小室檢測分別轉染了miR-96 ASO和NC的MCF-7細胞的侵襲和遷移活性。如Fig 3所示，通過轉染miR-96ASO下調MCF-7細胞內源性miR-96表達后，乳腺癌MCF-7細胞穿過基質膠的侵襲能力，以及遷移至小室膜的能力(未加入基質膠的遷移實驗)均較對照組明顯提高(P＜0.01)。

3 討論

miRNA一類長約18～22 nt的單鏈非編碼RNA，它具有多種調控基因表達的功能。研究表明，miRNA廣泛存在于真核生物中，在細胞發育、分化、增殖、凋亡、代謝以及腫瘤發生發展和轉移等過程中起重要作用。研究發現［2－3，6］，miRNA在多種常見惡性腫瘤中呈異常表達，并且其表達與腫瘤侵襲轉移等特性相關［7－9］。乳腺癌miR-335表達與患者無轉移生存期呈正相關，提示其在乳腺癌中可能起到抑癌基因的作用［10］;而miR-10b在轉移性乳腺癌細胞中高表達，并且與腫瘤的侵襲和轉移呈正相關，提示其可能起到癌基因的作用［11］。

為了探討miRNA參與乳腺癌發生發展的分子機制，本研究前期通過miRNA芯片技術檢測不同侵襲特性的人乳腺細胞株，篩選出大量差異性表達的miRNA，提示這些miRNA可能參與了乳腺癌侵襲過程［4－5］。前期miRNA芯片的研究結果表明，高侵襲性MDA-MB-231和MDA-MB-468細胞的miR-96表達量較低侵襲HBL-100和MCF-7細胞明顯下調。為了驗證芯片中miR-96表達的結果，本研究通過實時熒光定量PCR技術再次檢測了這4種乳腺細胞株的miR-96表達狀況，結果與miRNA芯片一致。進一步，本研究在臨床乳腺新鮮病變組織中檢測了miR-96的表達水平，結果顯示乳腺癌組織中miR-96也明顯下調，表明miR-96的表達下調可能與乳腺癌有關。但miR-96在乳腺癌發病過程中的具體作用及其對乳腺癌細胞生物學行為的影響，目前尚未清楚。為此，本研究使用化學合成的miR-96抑制物轉染乳腺癌細胞，下調細胞的 miR-196表達，觀察miR-96抑制物對細胞增殖、侵襲和遷移活性的影響。結果發現miR-96的下調對細胞增殖無明顯影響，卻可顯著提高乳腺癌細胞的侵襲和遷移活性。

Fig 3 Effect of miR-96 on MCF-7 cell behaviors of migration and invasion

目前關于miR-96在腫瘤中的作用尚存在一定的爭議。Yu等［12］發現miR-96能夠明顯抑制胰腺癌細胞的遷移和侵襲，并且miR-96通過調控其靶基因KRAS表達可能發揮抑癌基因的作用，本研究結果也與其大致相符。Chen等［13］的研究結果表明，miR-96在高轉移性肝癌HCCLM6中呈高表達，而下調miR-96的表達能夠明顯抑制HCCLM6細胞的侵襲和遷移;Lin等［14］研究發現MCF-7等9株乳腺癌細胞miR-96表達較1株乳腺正常上皮細胞NBEC明顯增高，同時15例臨床乳腺癌腫瘤組織miR-96較對應癌旁組織增高，并且miR-96具有促進乳腺癌細胞增殖的作用，提示miR-96可能具有癌基因的作用。因此，miR-96的作用比較復雜，可能通過多種的靶基因在不同腫瘤、不同病變階段中發揮不同的功能。

綜上所述，miR-96在人乳腺癌細胞株和乳腺病變組織中存在表達失調，并對人乳腺癌細胞的侵襲及遷移能力可能存在一定負性調控作用。

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