亞胺培南或美羅培南聯合利福平降低不動桿菌防耐藥突變濃度的體外研究

馬慧敏，胡立芬，葉 英，朱玉林，李家斌

(1.安徽醫科大學第一附屬醫院感染科，2.安徽省細菌耐藥監測中心，3.安徽醫科大學細菌耐藥研究所，4.安徽醫科大學第一附屬醫院藥劑科，5.國家中醫藥管理局中藥化學三級實驗室，安徽合肥 230022)

不動桿菌(acinetobacter)是醫院感染最常見的條件致病菌之一，廣泛分布于自然界、人體表面及體內。碳青霉烯類抗菌藥物是治療不動桿菌的王牌藥物，但隨著碳青酶烯類抗菌藥物在臨床的廣泛使用，在抗生素的選擇壓力下，耐碳青酶烯類不動桿菌日趨增多，如何防止耐藥的進一步蔓延是臨床上治療不動桿菌感染亟待解決的問題。近年耐藥突變選擇窗(mutant selection window，MSW)理論的提出［1］為抑制耐藥問題提供了新的思路和方法。防耐藥突變濃度(mutant prevention concentration，MPC)是指防止耐藥突變菌株被選擇性富集擴增所需的最低抗菌藥物濃度。它代表一個嚴格限制耐藥突變株選擇的抗菌藥物濃度閾值，可用于評價藥物的抗菌活性，反映藥物抑制耐藥突變菌株的選擇能力。目前關于碳青酶烯類聯合利福平對不動桿菌的MPC影響研究尚未見報道。為此本研究觀察亞胺培南西司他丁(imipenem and cilastatin，IMP)或美羅培南(meropenem，MER)單用及分別與利福平(rifampicin，RFP)聯合應用對不動桿菌的MPC影響，探討聯用抗菌藥物降低MPC、縮小MSW的規律，為臨床合理聯用現有抗菌藥物、防止耐藥菌的產生提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 安徽省細菌耐藥監測中心2010年收集的臨床分離標本。選取其中16株對亞胺培南、美羅培南均敏感的不動桿菌臨床分離株。

1.2 菌株鑒定 不動桿菌的鑒定以16S rDNA序列進行分類鑒定。正向引物27F:5'-AGAGTTTGATC (C/A)TGGCTCAG-3'(對應于E.coil 16S rDNA序列的第8～27個堿基位置)，反向引物 1492R:5'-TACGG(C/T)TACCTTGTTACGAC-3'(對應于E.coil 16S rDNA的第1 492～1 510個堿基位置)。PCR擴增產物經電泳檢測后直接交由上海生工生物工程技術公司進行純化和序列測定。運用Blast程序與數據庫中已存在的不動桿菌16SrDNA序列進行相似性比較分析。

1.3 抗菌藥物與培養基 IMP為杭州默沙東制藥產品;MER為日本住友制藥產品;RFP為沈陽雙鼎制藥產品。M-H培養基購自英國Oxiod公司。

1.4 實驗儀器 恒溫振蕩培養箱(國勝儀器廠，江蘇);細菌比濁儀(Oxiod，英國);32R低溫離心機(Hettich，德國);多點接種儀(AQS Manufacturing公司，英國)。

1.5 最低抑菌濃度測定

1.5.1 測定單獨應用時的MIC 按美國臨床實驗室標準化研究所(CLSI)2010年標準［2］采用瓊脂二倍稀釋法測定IMP、MER與RFP 3種抗菌藥物單獨用藥時的MIC并判斷結果。

1.5.2 測定聯合應用時的MIC 采用簡化棋盤法測定IMP、MER分別與RFP聯用時的MIC。

1.5.3 計算部分抑菌濃度(fractional inhibitory concentration，FIC)指數 FIC指數 =A藥聯合時的MIC/A藥單用時的MIC+B藥聯合時的MIC/B藥單用時的MIC。

1.5.4 判定標準 FIC指數≤0.5為協同作用;0.5＜FIC指數≤4為無關作用;FIC指數＞4為拮抗作用。判定標準參照文獻［3］。

1.6 防耐藥突變濃度(MPC)的測定［4-5］

1.6.1 含單藥瓊脂平板的配制 分別配制IMP、MER、RFP的MH瓊脂平板，以IMP、MER、RFP各自的MIC為最低濃度，通過二倍稀釋法配制1×MIC，2×MIC，4×MIC，8×MIC…，多個濃度系列的瓊脂平板，使藥物終濃度分別為IMP:0.125、0.25、0.5、1、2、…、128 mg·L-1，MER:0.125～128 mg·L-1，RFP:2～1 024 mg·L-1，每個濃度4個平板。

1.6.2 含兩藥瓊脂平板的配制 以IMP和MER的MIC、MPC為基準，采用二倍稀釋法配制含IMP和MER與RFP混合的MH瓊脂平板。具體方法:分別精密量取1 ml不同稀釋倍數濃度的IMP或MER+1 ml 80.0 mg·L-1RFP(RFP推薦給藥劑量下人體平均血藥濃度為4.0 mg·L-1，見文獻［6］)+ 18 ml MH培養基，在90 mm平皿中混勻，配制成一系列不同濃度梯度的含兩藥平板，最低濃度為IMP和MER的MIC，最高濃度為IMP和MER的單藥MPC，每個濃度4個平板。冷卻后置37℃孵箱中以除去瓊脂表面水分。

1.6.3 菌懸液制備 從新鮮過夜培養的細菌平板上挑取單個菌落接種于20 ml MH肉湯中37℃120次/分震蕩過夜培養，3 000 r·min-1離心后棄上清，再懸浮在200 ml MH肉湯中，震蕩培養6 h，3 000 r ·min-1離心棄上清，調整菌液濃度為3×1010CFU ·ml-1。

1.6.4 MPC的測定 取100 μl 3×1010CFU·ml-1菌液均勻涂布于含不同濃度藥物的MH平板上，每個濃度4個平板，使每個藥物濃度的細菌接種量為1.2×1010CFU。37℃培養72 h，以4個平板均無細菌生長的最低藥物濃度為MPC。對含單藥瓊脂平板的測定為單藥MPC，對含兩藥瓊脂平板的測定即為聯合用藥后的MPC。對接近MPC藥物濃度篩選出來的菌株接種于無藥物的MH平皿，傳代2次后再接種于原篩選藥物濃度的平板上，以確定其是耐藥突變株。以上實驗重復2次，取其均值。

1.7 統計學分析 數據分析采用SPSS11.0統計軟件對各組數據進行非參數檢驗。

2 結果

2.1 細菌鑒定結果 鮑曼不動桿菌(acinetobacter baumanii)8株;瓊氏不動桿菌(acinetobacter junii)5株;醋酸鈣不動桿菌(acinetobacter calcoaceticus)3株。

2.2 抗菌藥物對16株不動桿菌的MIC值 16株不動桿菌對IMP、MER均敏感，MIC值范圍均為0.125～0.5，對RFP的MIC值范圍為2～4，見Tab 1。

Tab 1 MICs of 3 antimicrobial agents against 16 strains of Acinetobacter(mg·L-1)

2.3 聯合藥敏 IMP、MER分別與RFP聯用后以無關作用為主，未見拮抗作用，協同作用所占的比例分別為25%(4/16)和6%(1/16)。如Tab 2所示。

Tab 2 FICs of imipenem or meropenem combination with rifampicin against 16 strains of Acinetobacter

2.4 抗菌藥物單用及聯合使用對不動桿菌的MPC和SI值 RFP單用對16株不動桿菌的MPC均＞1 024 mg·L-1。IMP或MER單用對16株不動桿菌的選擇指數(selectiveity index，SI=MPC/MIC)均為16～128;分別與RFP聯合使用SI均下降為1～32， IMP、MER單用對16株不動桿菌的MPC均為8～32，與RFP聯合使用MPC分別下降為0.25～8和0.5～8。見Tab 3。

Tab 3 MPCs(mg·L－1)and SIs for imipenem and meropenem alone and in combination with rifampicin respectively against 16 strains of Acinetobacter

3 討論

不動桿菌可以引起多種醫院感染，具有多重耐藥性，全世界范圍內包括中國在內的多個國家的醫院已經出現多重耐藥鮑曼不動桿菌(multidrug-resistant acinetobacter baumanni，MDR-Ab)的暴發和流行。MDR-Ab治療困難，病死率高，是目前臨床治療的難題。不動桿菌對一線藥物碳青霉烯類的耐藥率已從2003年的4.5%上升至2008年的48.1%～49.3%［7-8］。從MSW理論［1］來看:不動桿菌對碳青霉烯類藥物的耐藥率之所以在短時間內迅速上升，可能是由于體內碳青霉烯類藥物濃度處于不動桿菌的MIC和MPC之間，導致耐藥突變株被選擇性富集擴增，從而產生耐藥。MPC是MSW的上限，當藥物濃度高于MPC時，病原菌必須同時發生兩次或更多次耐藥突變才能生長，這樣出現耐藥突變體的概率將很低。Credito等［9］也提出當碳青霉烯類藥物濃度達到MPC以上時，才可能有效防止耐碳青酶烯類藥物突變體的產生，并測定了25株鮑曼不動桿菌臨床分離株對IMP的MPC50和MPC90值分別為4 mg·L-1和 64 mg·L-1，對 MER的 MPC50和MPC90值分別為8 mg·L-1和128 mg·L-1。這與本研究顯示的16株敏感不動桿菌對IMP和MER的MPC均為8～32 mg·L-1的結果稍有不同。這可能與上述25株鮑曼不動桿菌中包括部分碳青霉烯中介菌株有關。結合藥代動力學參數分析，按臨床推薦藥物劑量0.5 g單次靜脈輸注后，IMP和MER血漿峰濃度Cmax分別為35 mg·L-1和26 mg·L-1，本研究中有10株不動桿菌IMP的MPC值是8和16 mg·L-1，11株菌MER的MPC值也是8和16 mg· L-1，都低于血漿峰濃度Cmax，因此對于這些菌單獨應用碳青酶烯類藥物可能會限制耐藥突變體的產生。然而還有6株菌IMP的MPC值是32 mg· L-1，5株菌MER的MPC值是32 mg·L-1，都接近血漿峰濃度，而且IMP和MER在腦脊液等組織中的濃度低于血藥濃度［10］，因此感染部位的藥物濃度往往落在MSW之內，若要增大給藥劑量，可能產生較嚴重的副作用，所以此類藥物單獨使用不能完全限制耐藥突變體富集。

MSW理論提出了一種限制耐藥突變體產生的方法:當2種不同作用機制的抗菌藥物聯合應用，并同時處于各自的MIC以上時，細菌需要同時發生2種耐藥突變才能生長［11］，從而關閉或縮小MSW，防止耐藥菌產生。孫恩華等［12］報道美羅培南、頭孢他啶分別與環丙沙星、左氧氟沙星、阿米卡星、阿奇霉素聯合可以降低對銅綠假單胞菌的SI。梅清等［5］應用萬古霉素聯合利福平或磷霉素可以縮小耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥突變選擇窗。近年來利福平治療多重耐藥不動桿菌(MDR-Ab)的研究多有報道，體外和動物實驗均證實利福平治療MDR-Ab有效［13］，Pachón-Ibá?ez等［14-15］的研究證明RFP聯用亞胺培南對多重耐藥及泛耐藥不動桿菌引起的動物肺炎及腦膜炎模型療效較好。且體外聯合藥敏結果顯示，IMP或MER聯合RFP協同作用分別為25%和6%，以無關作用為主，無拮抗作用。這與Kiratisin等［16］報道IMP和MER分別與RFP對15株非多重耐藥不動桿菌聯合用藥，協同作用所占比例均為6.7%，均無拮抗作用的結果接近，因此碳青霉烯類抗菌藥物與RFP聯合用藥具有可行性。本研究中IMP或MER與RFP聯合使用后，MPC由單用時的8～32，分別下降為0.25～8和0.5～8，SI均由單用時的16～128下降為1～32，均下降了2～32倍，甚至出現了關閉MSW的情況，2號菌株關閉了IMP的MSW。4號菌株關閉了MER的MSW。本研究結果證實了IMP或MER與RFP聯合使用能縮小甚至關閉MSW，減少耐碳青霉烯不動桿菌的出現。

本研究初步探討了碳青霉烯類抗菌藥物與RFP聯合對不動桿菌MPC的影響，證實此種聯合方案能降低IMP和MER的MPC，縮小甚至關閉MSW，能有效防止耐藥突變體的富集。這為臨床合理應用碳青酶烯類抗菌藥物治療不動桿菌感染，減少耐碳青酶烯類不動桿菌突變體的出現提供了理論依據。由于體內環境復雜、影響因素多，體內藥物濃度不恒定，與體外研究存在一定的差異，因此尚需進行動物和臨床實驗進一步驗證聯合用藥時藥物代謝動力學與耐藥突變體選擇的關系。

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