liguzinediol對(duì)壓力超負(fù)荷大鼠心室重構(gòu)的影響

章嫡妮，郭 瑤，李卓瓊，李 偉，2，卞慧敏，2

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，2.江蘇省中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210046)

左心室壓力負(fù)荷過(guò)重見(jiàn)于高血壓，而高血壓患者心室重構(gòu)為心力衰竭的主要危險(xiǎn)因素［1］，高血壓的男性較血壓正常的男性患心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)增加了2倍，女性為 4倍，嚴(yán)重危害人類健康［2］。隨著ACEI抑制劑卡托普利的面市，人們把研發(fā)治療CHF藥物的重點(diǎn)逐漸集中到了尋找能夠延緩、逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)的藥物上來(lái)［3］。liguzinediol化學(xué)名為2，5-二羥甲基-3，6-二甲基吡嗪，是對(duì)TMP進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾后得到的化合物，前期研究發(fā)現(xiàn)，liguzinediol能提高正常大鼠和心衰大鼠的LVSP、±dp/dtmax等，具有較強(qiáng)的正性肌力作用［4］，能夠通過(guò)抗氧化應(yīng)激、抑制炎癥因子、抗心肌細(xì)胞凋亡等一系列途徑來(lái)改善心室重構(gòu)。較目前的抗心衰藥物而言，liguzinediol具有水溶性強(qiáng)、生物利用度高、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)，且藥效可以維持2 h以上。本文旨在通過(guò)縮窄大鼠腹主動(dòng)脈而造成壓力超負(fù)荷的模型，觀察給予liguzinediol對(duì)模型大鼠心功能、組織形態(tài)、膠原沉積和RAAS系統(tǒng)等方面進(jìn)行研究，以此來(lái)探討liguzinediol對(duì)壓力超負(fù)荷型心室重構(gòu)的影響。

1 材料

1.1 藥品及試劑 liguzinediol(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院李偉教授提供，批號(hào):20110506，純度: 98.57%);卡托普利(中美施貴寶制藥有限公司，批號(hào):1102031);氯化鈉(南京化學(xué)試劑有限公司，批號(hào):09052420449);羥脯氨酸(HYP)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào):20111002);Ⅰ型膠原ELISA試劑盒(美國(guó) Abcam 公司生產(chǎn)，批號(hào): 20110608-004);Ⅲ型膠原ELISA試劑盒(美國(guó)Abcam公司生產(chǎn)，批號(hào):20110608-007);血漿腎素活性放免藥盒(北京華英生物技術(shù)研究所，批號(hào): 20111204);血漿血管緊張素放免藥盒(北京華英生物技術(shù)研究所，批號(hào):20111207);血漿醛固酮放免試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所，批號(hào):20111206)。

1.2 儀器 RM6240系列多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠，批號(hào):L30080185);萊卡倒置顯微鏡(德國(guó)萊卡公司生產(chǎn));LDZ5-2型低速自動(dòng)平衡離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠生產(chǎn));SPECTRA MAX 190酶標(biāo)儀(AD公司生產(chǎn));LDZ5-2型低速自動(dòng)平衡離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠生產(chǎn));放免儀器(r-911全自動(dòng)放免計(jì)數(shù)儀)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ♂SD大鼠，180～220 g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào):SCXK(滬)2007-0005。

2 方法

2.1 大鼠壓力超負(fù)荷心室重構(gòu)模型制備［5］大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.36 g·kg－1麻醉，開(kāi)腹，順左腎向上找到左腎上腹主動(dòng)脈搏動(dòng)處，用玻璃分針?lè)蛛x腎上腹主動(dòng)脈，于雙腎動(dòng)脈下方穿一根4-0號(hào)手術(shù)線，其上平行放置6號(hào)半針頭，與腹主動(dòng)脈一同結(jié)扎，其后抽出針頭，于腹腔滴注青霉素抗感染，逐層關(guān)閉腹腔，術(shù)后連續(xù)3 d肌肉注射20萬(wàn)單位青霉素。假手術(shù)組手術(shù)方法同前，分離出腎上腹主動(dòng)脈但不結(jié)扎。造模1周后，隨機(jī)將大鼠分為6個(gè)組:模型組(model)、假手術(shù)組(sham)、liguzinediol低、中、高劑量組(5、10、20 mg·kg－1)以及卡托普利(10 mg·kg－1)組，連續(xù)灌胃給藥8周。

2.2 心功能測(cè)定 大鼠20%烏拉坦1.2 g·kg－1腹腔注射麻醉，仰位固定于恒溫手術(shù)臺(tái)上，四肢皮下插入心電圖針形電極，記錄心電圖(ECG)。待心電、溫度(37℃)穩(wěn)定后，胸鎖乳突肌內(nèi)側(cè)分離右頸總動(dòng)脈，頭端結(jié)扎進(jìn)行動(dòng)脈插管，經(jīng)壓力換能器與多導(dǎo)生理記錄儀相連用于記錄動(dòng)脈血壓變化:SBP、DBP、MAP，穩(wěn)定后記錄15 min，隨后插管往心室方向插入，直至出現(xiàn)心室壓力波形，穩(wěn)定后測(cè)量左心室功能指標(biāo):LVSP、LVEDP、+dp/dtmax、－dp/dtmax。

2.3 心肌組織形態(tài)學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 心功能指標(biāo)測(cè)定完成后，迅速開(kāi)胸取出心臟，于4℃生理鹽水中洗凈殘余血液，濾紙吸干表面水分，稱取全心質(zhì)量;再沿房室間隔剔除心房及右心室，稱取左心室(包括室間隔)的質(zhì)量。計(jì)算心臟質(zhì)量指數(shù)和左心室質(zhì)量指數(shù)來(lái)衡量心肌肥厚程度，分別以HMI和LVMI來(lái)表示［6］。沿平行于冠狀溝的平面將左心室切為兩部分，一部分固定于10%甲醛溶液中，常規(guī)石蠟包埋，HE染色，光鏡下觀察心肌組織的病理學(xué)變化。

2.4 心肌組織膠原沉積測(cè)定 靠心底的另一部分左心室凍存于－80℃冰箱中，用于HYP及Ⅰ型和Ⅲ型膠原的檢測(cè)。

2.4.1 心肌組織HYP含量測(cè)定 精確稱取組織濕重30 mg左右放入試管中，準(zhǔn)確加水解液0.5 ml，混勻。加蓋后95℃或者沸水浴水解20 min。調(diào)pH值至6.0～6.8左右，按試劑盒操作說(shuō)明書(shū)加入各種試劑，最后混勻并離心，取上清在550 nm處，1 cm光徑，蒸餾水調(diào)零，測(cè)各管吸光度。最后按以下公式進(jìn)行計(jì)算:

2.4.2 心肌組織Ⅰ型和Ⅲ型膠原測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法測(cè)定大鼠心肌組織中Ⅰ型和Ⅲ型膠原的含量。取左室心肌組織，稱取其質(zhì)量。加入PBS(pH 7.0～7.4)，緩沖液中加入1 μg·L－1蛋白酶抑制劑，勻漿，2 500 r·min－1離心20 min，離心后吸取上清。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

2.5 血漿學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 大鼠血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)完畢后，經(jīng)左頸總動(dòng)脈取血。將血液收集到預(yù)先加入抗凝劑的試管中，用于檢測(cè)PRA、AngⅡ和ALD水平，抗凝劑組成:EDTA 2Na(30 μl)，8-羥基喹啉(30 μl)，二巰基丙醇(15 μl)，與血液混勻后離心(3 000 r·min－1，10 min)，離心(3 000 r·min－1，10 min)，吸取上清液，于－80℃冰箱中保存待測(cè)。參考試劑盒說(shuō)明操作，采用放免法檢測(cè)AngⅡ和ALD。

3 結(jié)果

3.1 liguzinediol對(duì)壓力超負(fù)荷大鼠心功能的影響腹主動(dòng)脈縮窄大鼠SBP、DBP、MAP等均較假手術(shù)組大鼠明顯升高(P＜0.01)，且SBP及DBP均超過(guò)血壓正常值，表現(xiàn)出明顯的高血壓癥狀，說(shuō)明模型復(fù)制成功。卡托普利以及l(fā)iguzinediol各個(gè)劑量組均有一定的改善動(dòng)脈血壓的效應(yīng)，使SBP、DBP、MAP降低，其中l(wèi)iguzinediol 5、10、20 mg·kg－1劑量組與模型組比較差異均有顯著性(P＜0.05)。見(jiàn)Tab 1。

Tab 1 Effect of liguzinediol on aterial blood pressure in rats with abdominal aortic constriction(±s，n=8)

Tab 1 Effect of liguzinediol on aterial blood pressure in rats with abdominal aortic constriction(±s，n=8)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs model;#P＜0.05，##P＜0.01 model vs sham

Group Dose/ mg·kg－1·d－1SBP/mmHg DBP/mmHg MAP/mmHg Sham － 108.00±7.84 64.68±9.63 79.12±8.89 Model － 191.30±14.66## 135.98±16.65## 154.42±14.09## Captopril 10 119.13±15.61＊＊ 70.15±16.42＊＊ 86.48±14.91＊＊5 154.08±25.87＊＊ 108.08±24.60* 123.42±24.69＊＊liguzinediol 10 136.50±22.70＊＊ 83.58±15.70＊＊ 101.22±16.92＊＊20 129.71±25.43＊＊ 83.41±13.95＊＊ 98.85±14.91＊＊

腹主動(dòng)脈縮窄后，模型大鼠LVSP、±dp/dtmax較假手術(shù)組明顯升高(P＜0.01)，說(shuō)明造模9周后，大鼠心臟后負(fù)荷增加，血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生異常，左心室做功代償性增加;LVEDP卻沒(méi)有發(fā)生明顯改變，說(shuō)明手術(shù)9周后，大鼠左心室舒張功能并未受到影響，心功能仍然處于代償期，心臟為了維持對(duì)全身各組織器官的血供而增強(qiáng)收縮力。給藥后，liguzinediol各劑量組以及卡托普利均可以明顯降低LVSP(P＜0.05)，且liguzinediol的作用呈劑量依賴性。Liguzinediol 10、20 mg·kg－1組及陽(yáng)性對(duì)照藥卡托普利均能降低±dp/dtmax，與模型組大鼠差異有顯著性(P＜0.05)，且與假手術(shù)組相比差異無(wú)顯著性，表明liguzinediol可以調(diào)節(jié)±dp/dtmax至正常范圍。見(jiàn)Tab 2。

Tab 2 Effect of liguzinediol on left ventricular blood pressure in rats with abdominal aortic constriction(±s，n=8)

Tab 2 Effect of liguzinediol on left ventricular blood pressure in rats with abdominal aortic constriction(±s，n=8)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs model;##P＜0.01 model vs sham

Group Dose/mg·kg－1·d－1 LVSP/mmHg LVEDP/mmHg +dp·dtmax－1/ mmHg·s－1－dp·dtmax－1/ mmHg·s －1 Sham － 112.35±6.9 1.80±3.89 7339±1347 －5494±736 Model － 171.94±16.56## 2.41±1.97 11994±2752## －8235±1035## Captopril 10 132.89±23.27＊＊ 2.22±2.75 8537±2662＊＊ －6066±1686＊＊5 147.94±24.96* 3.00±1.73 9584±3273 －6460±1477* Liguzinediol 10 144.37±19.37* 2.23±2.43 8755±2303* －6025±757＊＊20 132.94±17.07＊＊ 3.50±3.45 7660±1920＊＊ －5734±1461＊＊

3.2 liguzinediol對(duì)壓力超負(fù)荷大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)的影響 腹主動(dòng)脈縮窄9周后，模型大鼠心臟為了代償后負(fù)荷的增加而發(fā)生肥厚，HMI和LVMI相應(yīng)增大，二者與假手術(shù)組大鼠比較差異有顯著性(P＜0.01)。給予liguzinediol可不同程度地改善心室肥厚現(xiàn)象，且呈劑量依賴性。見(jiàn)Tab 3。

HE染色光鏡下觀察，假手術(shù)組心肌細(xì)胞橫紋清晰，未見(jiàn)增生肥大、萎縮、斷裂，無(wú)細(xì)胞變性、壞死等病變，間質(zhì)無(wú)水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn);模型組心肌纖維排列紊亂、細(xì)胞橫徑變大，并可見(jiàn)局灶性心肌纖維變性壞死，纖維結(jié)締組織增生;liguzinediol各劑量組和卡托普利組能夠不同程度地改善這一現(xiàn)象。見(jiàn)Fig 1。

Tab 3 Effect of liguzinediol on HMI and LVMI of LVH rats induced by abdominal aortic constriction(±s，n=8)

Tab 3 Effect of liguzinediol on HMI and LVMI of LVH rats induced by abdominal aortic constriction(±s，n=8)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs model;##P＜0.01 model vs sham

Group Dose/ mg·kg－1·d－1HMI/mg·g－1 LVMI/mg·g －1 Sham － 2.60±0.23 1.60±0.15 Model － 4.44±0.45## 2.55±0.23## Captopril 10 3.51±0.83* 2.05±0.46* 5 3.90±0.70 2.25±0.39 Liguzinediol 10 3.81±0.45* 2.20±0.34* 20 3.84±0.323＊＊ 2.22±0.27*

3.3 liguzinediol對(duì)壓力超負(fù)荷大鼠心肌組織膠原沉積的影響 模型大鼠心肌組織HYP含量明顯增加(P＜0.01)，各給藥組均有降低HYP的作用，liguzinediol能夠劑量依賴性地降低HYP含量，與模型組相比差異有顯著性(P＜0.01)，見(jiàn)Tab 4。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各組膠原含量，并作出比值，見(jiàn)Fig 2和Fig 3。結(jié)果顯示:與模型組相比，Ⅰ型膠原含量明顯增加(P＜0.05)，就兩者比值而言，模型組大鼠心肌組織中Ⅰ/Ⅲ型膠原比值也明顯增加(P＜ 0.01)，表明腹主動(dòng)脈縮窄誘導(dǎo)大鼠心肌間質(zhì)膠原沉積。給予liguzinediol能明顯降低二者比值(P＜0.05)，改善膠原沉積現(xiàn)象。3組Ⅲ型膠原之間雖有變化，但差異均無(wú)顯著性。見(jiàn)Tab 5。

Fig 1 Heart tissues.HE stain(200×)

Tab 4 Effect of liguzinediol on the content of HYP in the rats’heart(±s，n=8)

Tab 4 Effect of liguzinediol on the content of HYP in the rats’heart(±s，n=8)

＊＊P＜0.01 vs model;##P＜0.01 model vs sham

Group Dose/mg·kg－1·d－1 HYP/mg·g －1 Sham － 0.16±0.03 Model － 0.46±0.08## Captopril 10 0.24±0.06＊＊5 0.24±0.07＊＊liguzinediol 10 0.23±0.03＊＊20 0.20±0.02＊＊

3.4 liguzinediol對(duì)壓力超負(fù)荷大鼠血漿RAAS的影響 腹主動(dòng)脈縮窄大鼠血漿中PRA、AngⅡ、ALD水平較假手術(shù)組明顯上升(P＜0.01)，卡托普利和liguzinediol均能夠明顯降低AngⅡ、ALD血漿水平，尤其對(duì)ALD的降低最為明顯。但是各藥均不能降低PRA。結(jié)果表明，liguzinediol主要是通過(guò)降低血漿中AngⅡ、ALD的含量來(lái)影響RAAS的。見(jiàn)Tab 6。

Tab 5 Effect of liguzinediol on the of collagen type I:Ⅲratio in rats with abdominal aortic constriction(±s，n=6)

Tab 5 Effect of liguzinediol on the of collagen type I:Ⅲratio in rats with abdominal aortic constriction(±s，n=6)

*P＜0.05 vs model;#P＜0.05，##P＜0.01 model vs sham

Group Dose/ mg·kg－1·d－1 Type I collagen/ μg·L－1 TypeⅢcollagen/ μg·L－1 I/ⅢSham － 30.23±2.82 6.92±0.36 4.36±0.23 Model － 34.56±1.81# 6.67±0.27 5.31±0.32## liguzinediol 20 34.08±1.59 6.97±0.50 4.90±0.30*

Fig 2 Standard curve of collagen type I of isolated rat hearts by Elisa

Fig 3 Standard curve of collagen typeⅢof isolated rat hearts by Elisa

4 討論

腹主動(dòng)脈縮窄是由于腎血流量相對(duì)減少，激活RAAS，引起血管收縮，血壓升高，心臟后負(fù)荷進(jìn)一步增加，而長(zhǎng)期負(fù)荷過(guò)重是引起心室重構(gòu)的主要原因。心室重構(gòu)的臨床表現(xiàn)為心肌重量、心室容量的增加和心室形態(tài)的改變。本實(shí)驗(yàn)造模9周后 HMI及LVMI增加，說(shuō)明模型大鼠心臟已經(jīng)發(fā)生了器質(zhì)性改變，形成心室重構(gòu);蔡輝等［6］報(bào)道相同模型大鼠心肌纖維排列紊亂、細(xì)胞橫徑變大，并可見(jiàn)局灶性心肌纖維變性壞死，纖維結(jié)締組織增生，本研究模型組結(jié)果與這一現(xiàn)象相符，說(shuō)明模型復(fù)制成功，而給予卡托普利和liguzinediol各劑量組治療后，HMI、LVMI以及心肌組織病理學(xué)均得到不同程度的改善。

Tab 6 Effect of liguzinediol on AngⅡ，PRA and ALD of rats with abdominal aortic constriction(±s，n=8)

Tab 6 Effect of liguzinediol on AngⅡ，PRA and ALD of rats with abdominal aortic constriction(±s，n=8)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs model;##P＜0.01 model vs sham

Group Dose/ mg·kg－1·d－1 PRA/ μg·L－1·h－1 AngⅡ/ ng·L－1 ALD/ ng·L －1 Sham － 2.91±0.13 120.40±18.03 93.39±11.87 Model － 3.72±0.24## 142.28±5.85## 124.59±8.28## Captopril 10 3.55±0.22 125.51±14.64＊＊ 90.16±8.70＊＊5 3.75±0.19 133.33±8.06* 108.44±5.63＊＊liguzinediol 10 3.61±0.31 129.62±10.48* 99.93±13.75＊＊20 3.48±0.31 124.69±12.10＊＊ 97.75±9.42＊＊

本實(shí)驗(yàn)腹主動(dòng)脈縮窄大鼠SBP、DBP、MAP均明顯升高，表現(xiàn)出高血壓癥狀;而LVSP、±dp/dtmax也明顯升高，說(shuō)明心臟后負(fù)荷增加，左心室做功代償性增加;LVEDP卻沒(méi)有明顯改變，說(shuō)明術(shù)后9周左心室舒張功能并未受到影響，心功能仍處于代償期，心臟為了維持對(duì)全身各器官組織血供而增強(qiáng)收縮力。給藥后，liguzinediol各劑量組以及卡托普利均可不同程度降低SBP、DBP、MAP、LVSP、±dp/dtmax，說(shuō)明liguzinediol能通過(guò)降低過(guò)高的后負(fù)荷，來(lái)改善大鼠血流動(dòng)力學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)，改善心功能。

纖維性膠原是心臟中最多的膠原類型，其中最經(jīng)典的是Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原［7］，而本實(shí)驗(yàn)造成的模型尚處于心肌肥厚導(dǎo)致心肌重構(gòu)的早期(代償性)，此階段主要與Ⅰ型膠原沉積，Ⅰ/Ⅲ型膠原比例增高有關(guān)，而Ⅲ型膠原變化不大［8］;測(cè)定心肌組織HYP含量可反映心肌膠原蛋白的含量，從而判斷心肌間質(zhì)細(xì)胞增殖和纖維組織增生的程度。本研究顯示，模型大鼠Ⅰ/Ⅲ型膠原比例及心肌組織HYP含量與假手術(shù)組相比明顯增加，說(shuō)明壓力超負(fù)荷導(dǎo)致心肌組織膠原沉積增加、心肌纖維化發(fā)生、心肌僵硬度增加，而liguzinediol可以減小Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的比值及HYP含量，提示liguzinediol可以通過(guò)減少膠原沉積來(lái)改善心肌纖維化。

心室重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展中，伴隨著RAAS系統(tǒng)的激活，進(jìn)而促進(jìn)一系列內(nèi)源性神經(jīng)內(nèi)分泌因子的生成，其中主要的效應(yīng)分子為腎素、AngⅡ和ALD，對(duì)心血管疾病的發(fā)展起著重要作用［9－10］。本實(shí)驗(yàn)中模型大鼠血漿PRA活性、AngⅡ、ALD含量較假手術(shù)組均明顯升高，三者相互關(guān)聯(lián)、相互促進(jìn)，共同參與心室重構(gòu)的病理進(jìn)程。Doeving等［11］報(bào)道卡托普利可以降低血漿AngⅡ及ALD水平，但并不能降低PRA水平，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。liguzinediol也只能降低血漿AngⅡ及ALD水平，而不能降低PRA水平，提示liguzinediol抑制RAAS活性的作用可能主要是通過(guò)降低AngⅡ、ALD來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

由此可見(jiàn)，liguzinediol能改善壓力超負(fù)荷大鼠的心室重構(gòu)，且具有一定的劑量依賴性，其作用機(jī)制可能與抑制RAAS活性有關(guān)，其他機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

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