銀杏葉提取物對大鼠糖尿病性白內障防治作用的研究

劉 玲，魯 茜，楊婷婷，張 帆，尹家樂，杜 蕾，印曉星

(徐州醫學院藥學院1.新藥與臨床應用實驗室，2.臨床藥理學教研室，江蘇徐州 221000)

糖尿病是一種因體內胰島素絕對或者相對不足而導致的一系列臨床綜合征。隨著人們生活方式改變、人口老齡化問題日益加劇，糖尿病患者人數迅速增加。在我國，高達62.37%的2型糖尿病患者會出現不同程度的晶狀體混濁即糖尿病性白內障(diabetic cataract，DC)，且發病率隨病程的延長而明顯增加。DC的發病機制比較復雜，涉及多種因素，其中醛糖還原酶(aldose reductase，AR)的激活和表達上調，糖基化終末產物(advanced glycosylation end products，AGEs)的大量積聚以及活性氧(reactive oxygen species，ROS)誘發的氧化應激損傷等被認為是DC發病的關鍵環節［1-4］。

銀杏葉提取物(Ginkgo biloba extract，GBE)是采用現代提取技術從銀杏葉中提取的活性成分，其有效成分主要包括黃酮苷類和萜類［5］。本課題組前期研究發現，GBE可以通過其抗氧化作用及抑制AGEs、AR的作用，抑制高糖誘發的人晶狀體上皮細胞的凋亡，這對于延緩糖尿病性白內障的發生具有極其重要的意義［6］。為進一步驗證GBE對DC的療效，并探索其防治DC的機制，我們在鏈脲霉素(streptozotocin，STZ)誘導的糖尿病性白內障大鼠上觀察了GBE對其晶狀體混濁度、抗氧化指標、糖基化終產物含量和醛糖還原酶表達的影響，以抗白內障藥物芐達賴氨酸(bendazac lysine，BDL)作為陽性對照藥，通過上述實驗明確GBE對DC的防治作用，并初步探討其作用機制，以期能為DC的防治尋找新的藥物，為增加GBE的臨床適應癥提供科學的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康♂SD大鼠，體質量150～190 g，經散瞳后檢查晶狀體無異常，由徐州醫學院實驗動物中心提供，許可證號SYXK 2002-0038。

1.2 主要試劑 STZ，美國Calbiochem公司;GBE (含銀杏黃酮＞24%，萜類＞6%)，邳州富偉生化有限公司;芐達賴氨酸，浙江平湖莎普愛恩制藥有限公司;大鼠AGEs酶聯免疫試劑盒，美國R＆D公司;羊抗AR多克隆抗體，美國Santa Cruz公司;兔抗β-Tubulin抗體美國Bioworld公司;T-SOD試劑盒、CAT可見光試劑盒、GSH試劑盒購自南京建成生物工程研究所。其余試劑均為國產分析純。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及模型制備 SD大鼠隨機分為正常對照(NS)組(8只)和糖尿病造模組(50只)。禁食24 h后，腹腔一次性注射STZ 65 mg·kg-1，NS注射等量檸檬酸鈉緩沖液(pH=4.4)。72 h后尾靜脈取血，測定空腹血糖≥13.88 mmol·L-1者為造模成功。將造模成功的SD大鼠隨機分為5組:DC模型組(DC)、GBE低劑量治療組(GL)、GBE中劑量治療組(GM)、GBE高劑量治療組(GH)、芐達賴氨酸(BDL)對照組，各組8只。各組成模當日作為實驗d 1，低中高GBE治療組劑量分別為50、100、200 mg·kg-1，BDL組的劑量為200 mg·kg-1，均以1 %羧甲基纖維素配成不同濃度的混懸液灌胃給藥，每天1次，NS組、DC模型組均給予同體積的1%羧甲基纖維素。所有動物在整個實驗期間均喂標準飲食，自由飲水，不應用其它藥物。

1.3.2 樣本收集 給藥12周后，測定各組大鼠血糖水平，稱重麻醉后迅速摘除雙眼眼球，顯微鏡下分離晶狀體，仔細剔除晶狀體上附著的虹膜及懸韌帶，稱重標記，-80℃冰箱保存待用。

1.3.3 晶狀體混濁度的分級 1%托品酰胺滴眼液點大鼠雙眼1次，5min后使用裂隙燈觀察晶狀體變化，觀察和記錄大鼠晶狀體形態的改變，并將晶體混濁程度參照Azuma等［7］的標準分為5級:Ⅰ級:無混濁，晶體透明;Ⅱ級:輕度混濁，晶體周邊出現空泡;Ⅲ級:中度混濁，晶體周邊空泡向中心擴展，核出現霧狀混濁;Ⅳ級:高度混濁，晶體周邊空泡擴展到核區，核霧狀混濁加重;Ⅴ級:核混濁，白內障成熟。

1.3.4 抗氧化指標的測定 每組各取6個晶狀體制備晶狀體勻漿液。將低溫保存的晶狀體標本吸干水分后，按重量體積比加入預冷的生理鹽水制備成10%的組織勻漿，4 000 r·min-1，低溫離心 10 min，取上清，分裝待測。參照試劑盒說明測定CAT、GSH、T-SOD水平。

1.3.5 糖基化終末產物(AGEs)含量測定 取大鼠晶狀體勻漿液，采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法(ELISA)測定樣品中大鼠晚期糖基化終末產物(AGEs)的水平，具體操作參照試劑盒說明。

1.3.6 免疫印跡測定醛糖還原酶(AR)相對表達量采用BCA法測定樣品蛋白濃度。將所有蛋白樣品調至等濃度，充分混合沉淀后加樣緩沖液后按50 μg/孔上樣，經10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，以半干轉法轉移至硝酸纖維素膜上。室溫封閉3 h后加入按1∶200濃度稀釋的羊抗AR多克隆抗體，4℃過夜。用洗滌液洗膜，加入相應的二抗(驢抗山羊Ig-AP)，室溫孵育2 h。洗膜3次，以硝基藍四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸(NBT/BCIP)顯色，水洗終止反應。β-tubulin以相同方法檢測。結果以Image J圖像軟件分析處理，測定條帶灰度值，蛋白表達的變化以實驗組中相應條帶的灰度值相對于β-tubulin的倍數表示。

1.3.7 統計學處理 各組數據用SPSS 13.0統計軟件處理，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，兩組間比較采用q檢驗。等級資料用非參數秩和檢驗進行分析。

2 結果

2.1 對大鼠生理情況的影響 正常組大鼠活動頻繁、毛發光澤、飲水量正常、尿量正常。DC組大鼠活動度低、眼球蒼白、毛發枯黃無色澤、豎毛弓背、飲水量高、尿量多。GBE中、高劑量治療組大鼠“三多一少”癥狀有所緩解，而飲水量和尿量仍然較高，墊料較潮。GBE低中高劑量組大鼠空腹血糖有一定程度的降低，但仍處于高血糖水平，與DC組比較差異無統計學意義(Tab 1)。

Tab 1 Effects of GBE on fasting blood glucose in diabetic rats(mmol·L-1，±s，n=6)

Tab 1 Effects of GBE on fasting blood glucose in diabetic rats(mmol·L-1，±s，n=6)

##P＜0.01 vs NS group

Group 0 wk 12 wk NS 5.98±0.72 5.77±1.02 DC 26.34±3.15## 27.91±3.40## GL 25.66±2.71 25.07±2.87 GM 27.37±2.09 25.31±2.18 GH 26.31±2.43 24.10±2.33 BDL 25.15±3.06 24.01±2.97

2.2 GBE對晶狀體混濁度的影響 經裂隙燈顯微鏡檢查，正常對照組大鼠晶狀體透明，無混濁發生。DC組大鼠晶狀體混濁度明顯高于正常對照組，出現霧狀混濁、核混濁，多為Ⅲ～Ⅴ級。GBE中、高劑量組與DC組相比，大鼠晶狀體混濁度有所減輕，其混濁度等級差異有顯著性(P＜0.05或P＜0.01)，提示GBE可降低DC大鼠晶狀體混濁度，對DC大鼠晶狀體出現混濁具有一定的抑制作用。BDL組晶狀體混濁度等級與DC組相比無統計學意義(Tab 2)。

Tab 2 Effects of GBE on grading of lens opacification of rats(n=12)

Fig 1 Effect of GBE on cataractogenesis of rats

2.3 GBE對氧化應激的影響 與正常組相比，DC組大鼠晶狀體組織中T-SOD活性，CAT活性和GSH含量明顯降低(P＜0.01)，表明其抗氧化能力下降。與DC組相比，GBE高劑量治療組的T-SOD活性，CAT活性和GSH含量升高(P＜0.01)，GBE中劑量組的各項指標也有升高(P＜0.05)。BDL組T-SOD活性升高(P＜0.05)，GSH含量與CAT酶活力水平無明顯變化(Tab 3)，此結果表明GBE能明顯改善DC大鼠晶狀體的氧化應激狀態，且在抗氧化作用方面較BDL更強。

Tab 3 Effects of GBE on the activities of the CAT，T-SOD and the level of GSH of lens in diabetic rats(±s，n=6)

Tab 3 Effects of GBE on the activities of the CAT，T-SOD and the level of GSH of lens in diabetic rats(±s，n=6)

##P＜0.01 vs NS group;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs DC group

Group T-SOD/ U·mg-1Pro GSH/ mg· g-1Pro CAT/ U·mg-1Pro NS 23.95±1.89 4.79±0.69 4.07±0.26 DC 9.10±1.58## 1.67±0.44## 2.44±0.30## GL 11.28±2.05 2.05±0.22 2.68±0.33 GM 12.76±1.63* 2.54±0.50＊＊ 2.82±0.37 GH 16.97±2.88＊＊ 2.82±0.37＊＊ 2.98±0.31＊＊BDL 12.72±3.11*2.20±0.70 2.62±0.38

2.4 GBE對AGEs含量的影響 與正常組相比，DC組大鼠晶狀體組織中的AGEs相對含量明顯升高(P＜0.01)。與DC組相比，GBE高劑量治療組的AGEs明顯下降(P＜0.05)。BDL組大鼠晶狀體組織中AGEs含量無明顯降低(Tab 4)，提示GBE能夠抑制DC大鼠晶狀體AGEs的生成。

2.5 GBE對AR表達水平的影響 DC組大鼠晶狀體組織中AR的相對表達量與正常組相比明顯增多，差異有統計學意義(P＜0.01)。GBE高劑量治療組的AR表達水平與DC組相比皆有明顯降低(P＜0.01)。BDL治療組的AR表達水平與DC對照組相比差異也有顯著性(P＜0.01)。

Tab 4 Effects of GBE on the level of AGEs of lens in diabetic rats(±s，n=6)

Tab 4 Effects of GBE on the level of AGEs of lens in diabetic rats(±s，n=6)

#P＜0.01 vs NS group;*P＜0.05 vs DC group

Group AGEs/ng·g-1Pro NS 8.77±1.02 DC 16.91±2.40# GL 15.07±2.77 GM 14.31±2.08 GH 13.70±2.33* BDL 15.01±3.06

Fig 2 Effect of GBE on the expression of AR of lens in diabetic rats(±s，n=6)

3 討論

白內障(cataract)即晶狀體混濁，老化、遺傳、代謝異常等因素可引起晶狀體代謝紊亂，導致蛋白質變性而出現混濁，發生白內障，糖尿病是其重要的危險因素之一［8］。大量研究表明，糖尿病患者白內障的發生率明顯高于非糖尿病患者，且晶狀體混濁的發生速度更快，表明高糖在DC形成過程中是始動因素，且是晶狀體混濁的主要誘發因素。長期的實驗室研究和臨床觀察對DC的發病機制提出了多種不同的學說，其中較為成熟的學說主要有3種，即多元醇代謝異常學說、非酶糖基化學說和氧化應激學說［9］。近期研究更傾向認為DC是多種機制綜合作用的結果，這幾種機制相互關聯，都參與了白內障的形成。

氧化應激在DC的病理進程中扮演著非常重要的角色。大量證據表明，在高糖環境下，葡萄糖自身氧化作用、葡萄糖非酶糖基化形成晚期糖基化終末產物的過程中、高糖激活的多元醇途徑以及PKC的活化均產生大量ROS，從而消耗大量還原性谷胱甘肽，嚴重削弱機體的抗氧化防御系統，使其處于氧化應激狀態［10-11］。超氧化物歧化酶、谷胱甘肽和過氧化氫酶均是晶狀體內抗氧化的關鍵物質，我們對晶狀體中這3種酶進行測定后，發現在糖尿病大鼠晶狀體組織中它們的活性或含量均明顯下降。這樣的變化必然會導致晶狀體更易受到氧化劑的攻擊，致使晶狀體蛋白質發生氧化損傷，最終發生晶狀體混濁。在本實驗中，GBE能夠明顯提高DC大鼠晶狀體內CAT、T-SOD的酶活性及GSH的含量，幫助維持晶狀體內正常的氧化還原狀態，且與對照藥BDL相比，GBE的抗氧化作用更強也更廣泛。這可能是由于GBE能夠有效地阻止氧自由基進入晶狀體組織，抵抗氧自由基對蛋白質、膜磷脂和核酸造成的氧化損傷，同時消除氧自由基反應生成的其他有害物質。

AGEs是由蛋白質、脂質及DNA等與還原糖之間形成的非酶促糖基化終末產物，其形成是一個不可逆的化學過程，一經形成即不斷累積于組織中，影響組織的結構和功能。AGEs的形成被認為是糖基化過程中的中介體，存在于包括糖尿病性白內障在內的多種糖尿病并發癥中。研究發現糖尿病患者白內障的房水中AGEs產物大量堆積，證實了AGEs與糖尿病患者白內障的發病密切相關［12］。此外，AGEs的產生與氧化應激也有著密切的聯系。氧化應激狀態的持續存在可促進AGEs的不斷生成，同時AGEs與其受體的結合又可刺激ROS的產生，氧化應激和AGEs相互作用、互相上調，共同加速DC的形成［13］。本實驗中，DC組大鼠晶狀體中的AGEs相對含量與正常對照組相比明顯升高;高劑量的GBE能使AGEs水平下降，說明GBE能夠有效降低DC大鼠晶狀體中AGEs的生成和積聚，這對DC的防治頗具意義。而BDL治療組大鼠的晶狀體AGEs含量未有明顯降低。

多元醇代謝通路是葡萄糖代謝通路之一，與DC的病理進程有著極其密切的關系，AR是該通路的限速酶也是氧化還原通路的最后的共同步驟。已有研究發現，AR在晶狀體是高糖誘發氧化應激的關鍵酶。在晶狀體過度表達AR的小鼠上，其DC的形成可大大提前［14］。多元醇通路的激活還會引起NADPH的大量消耗和NADH聚集，導致來源于二羥基丙酮磷酸鹽的二酰甘油明顯增加，激活蛋白激酶C，生成氧自由基，造成氧化應激，加速糖尿病性白內障的發生發展［15］。本實驗中，DC大鼠的AR表達明顯增多，表明高糖能使AR表達上調。高劑量GBE即可明顯抑制其表達，因此GBE可以改善因AR表達增多所誘發的一系列與DC相關的癥狀; BDL由于是AR抑制劑，其抑制AR表達的效果更為明顯。

綜合以上的實驗結果可見，GBE可減輕大鼠糖尿病性白內障引起的晶狀體混濁，這種作用可能與GBE抑制AGEs產生、AR表達以及蛋白質氧化損傷有關，展現出GBE作為天然藥物多靶點治療的優勢，同時也為多元醇代謝異常學說、非酶糖基化學說和氧化應激學說提供了實驗依據。

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