南瓜蛋白聯合吉非替尼對人胰腺癌BxPC-3細胞的抑制作用

謝捷明，楊愛琴，王叢菲，黃鶴光，張寶明，吳雪燕，陳明晃

(1.福建醫科大學藥學院藥理學系，福建福州 350004;2.福建醫科大學附屬協和醫院基本外科，福建福州 350001; 3.中國科學院福建物質結構研究所，結構化學國家重點實驗室，福建福州 350002)

胰腺癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，其惡性度高、早期診斷率低、預后差，且發病率在全球范圍內呈逐年上升趨勢，已成為威脅人類健康的主要疾病之一［1］。目前手術治療是唯一有效可行的治療胰腺癌的方法，但患者5年生存率也僅達15%～25%［2］。對于中晚期的胰腺癌患者而言，以化療為主的綜合治療方案是目前胰腺癌的重要治療手段。自1996年吉西他濱(gemcitabine，GEM)問世以來，其在胰腺癌化療中的地位一直未被替代［3］。然而GEM緩解率較低、存在固有及獲得性耐藥現象以及其嚴重的毒副作用限制了其在臨床中的應用［4］。近年，隨著與胰腺癌發生、發展、侵襲和轉移相關的分子標記物的逐步闡明，針對胰腺癌的特異性分子靶點設計的抗腫瘤藥物相繼產生，其中就有針對表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的酪氨酸激酶抑制劑，代表藥物如厄洛替尼、吉非替尼，但此類藥物也未能從本質上提高患者的五年生存率［5］。因此研發一種新型的高效、低毒、多靶點作用的藥物，尤其是能與現有化療藥物產生協同作用的聯合治療方案具有重要的意義。

南瓜蛋白(cucurmosin，CUS)是本課題組率先從南瓜果肉中提取的新的Ⅰ型核糖體失活蛋白，相對分子質量28 203，為堿性單肽鏈糖蛋白，其一、二、三級結構已測定［6－8］。我們前期的研究表明，CUS能顯著抑制多種腫瘤細胞增殖，且活性比同類的天花粉蛋白強2～7倍［9－17］;本課題組近期實驗證實，CUS可在翻譯水平明顯下調人胰腺癌BxPC-3細胞EGFR蛋白的表達，抑制EGFR信號通路可能是CUS抗胰腺癌作用的重要機制［18］。本研究以人胰腺癌BxPC-3細胞作為對象，進一步探索CUS聯合GEF的協同抗胰腺癌作用，旨在探尋新的胰腺癌化療的有效聯合方案。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑 人胰腺癌細胞株BxPC-3購自上海生命科學研究院。CUS由本課題組提取制備，純度為97%，采用BCA法進行蛋白質定量，過濾除菌后分裝，－70℃冰箱保存;實驗時用培養液稀釋為不同濃度使用。RPMI 1640培養基和胎牛血清均購自美國Gibco公司。吉非替尼購于英國阿斯利康公司，取GEF片充分研磨后精密稱定，用一定量的二甲基亞楓(DSMO)溶解，使之終濃度為50 mmol· L－1，置4℃備用。二甲基亞楓、磺酰羅丹明B(Sulforhodamine B，SRB)和吉姆薩染料(Giemsa)均為美國Sigma公司產品。BCA蛋白濃度測定試劑盒購于南京凱基生物科技公司。EGFR抗體購自Bioworld公司，Actin抗體及二抗購自美國Pierce公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 細胞培養 BxPC-3細胞用含質量分數10%胎牛血清及80 KU·L－1慶大霉素的RPMI 1640培養基，置37℃、5%CO2及飽和濕度條件下常規貼壁培養，2～3 d傳代，取對數生長期細胞用于實驗。

1.3 SRB法測定CUS與GEF聯合應用對BxPC-3細胞增殖的影響 用質量分數為0.25%的胰酶(含質量分數為0.02%的 EDTA)消化BxPC-3細胞，培養液重懸制備成單細胞懸液，以每孔6 000個細胞的密度接種于96孔培養板，置培養箱內24h待細胞貼壁后加入干預藥物。實驗設CUS干預組、GEF干預組、聯合用藥組及陰性對照組:CUS干預組藥物的終濃度分別為 0.0078125、0.015625、0.03125、0.0625、0.125及0.25 μmol·L－1，GEF干預組藥物終濃度分別為2、4、8及16 μmol·L－1，聯合用藥組為上述兩組藥物各濃度的兩兩組合，陰性對照組未加入藥物;每組均設4個以上復孔，每孔總體積為200 μl。培養箱孵育72 h后取出，棄上清液控干水分，每孔加100 μl 4℃預冷的質量分數為10%的三氯醋酸，靜置5 min后于4℃處避光保存1h以上;取出培養板用雙蒸水洗滌5遍，控干水分;每孔加入質量分數為0.4%的SRB液50 μl靜置染色15 min;用質量分數為1%的醋酸洗滌5遍，控干水分;每孔加入150 μl 10mmol·L－1Tris溶液，靜置5 min，于振蕩器上振蕩使之完全溶解。用酶標儀在570 nm波長處測定吸光度值(A)。按以下公式測得存在不同藥物濃度時細胞的增殖抑制率:抑制率/%=(1－藥物干預組A570/空白對照組A570)× 100%，取各復孔平均值，計算各組的增殖抑制率;實驗重復3次。

1.4 集落形成實驗檢測CUS與GEF聯合應用對BxPC-3細胞集落形成率的影響 消化BxPC-3細胞(臺盼藍染色法計算活細胞數達98%上)，制備成單細胞懸液，以每孔300個細胞的濃度接種于24孔板內，置培養箱內24 h待細胞貼壁后加藥。實驗設CUS干預組、GEF干預組、聯合用藥組和陰性對照組:CUS干預組藥物終濃度為0.03125及0.0625 μmol·L－1，GEF干預組藥物終濃度為2、4及8 μmol·L－1，聯合用藥組為上述兩組藥物各濃度的兩兩組合，陰性對照組未加入藥物;每組均設4個復孔，每孔總體積為1 000 μl。置培養箱內培養14 d在倒置顯微鏡下觀察可見細胞克隆團形成，多數克隆團含50個細胞以上即可取出，棄上清，4℃預冷的PBS洗滌2次，加吉姆薩染液3～4滴覆蓋住細胞層染色5 min，用清水洗凈，自然干燥后顯微鏡下計數，取各復孔平均值，按如下公式計算集落抑制率:集落抑制率/%=(1－藥物干預組集落形成率/陰性對照組集落形成率)×100%;實驗重復3次。

1.5 Western blot檢測CUS與GEF聯合應用對BxPC-3細胞EGFR蛋白表達的影響 取BxPC-3細胞經消化制備成單細胞懸液，以每皿200萬個細胞的濃度接種于直徑10 cm的培養皿中內，置培養箱內24 h待細胞貼壁后加藥。分別設置陰性組、CUS(0.25 μmol·L－1)、GEF(8 μmol·L－1)和CUS (0.25 μmol·L－1)聯合GEF(8 μmol·L－1)3個干預組及陰性對照組。置溫箱培養72 h后取出，棄上清，4℃預冷的PBS洗滌2次，細胞裂解液(50 mmol ·L－1Tris-HCl pH 7.5，0.15 mol·L－1NaCl，1% Na-deoxyoholale，1 mmol·L－1EDTA，1%Triton X-100，0.1%SDS，1 mmol·L－1PMSF)裂解細胞，提取細胞總蛋白并行BCA定量。蛋白變性后以100 μg·20 μl－1上樣行SDS-PAGE電泳，后250 mA恒電流75 min轉至PVDF膜，用質量分數為3%的BSA封閉4 h，一抗(1∶1 000 EGFR、1∶1 000 Actin)4℃孵育過夜，洗膜后二抗室溫孵育1 h，再洗膜，常規暗室內ECL顯色、曝光、顯影、定影，結果掃描并由Quantity One 4.62軟件分析，得到各組EGFR和內參(Actin)條帶的灰度值，以陰性對照組為1，求得各組EGFR和內參灰度值的相應比值;實驗重復3次。

2 結果

2.1 CUS與GEF聯合應用對人胰腺癌BxPC-3細胞的增殖抑制作用 SRB結果顯示，單用 CUS (0.0078125、0.015625、0.03125、0.0625、0.125及0.25 μmol·L－1)干預BxPC-3細胞72h對其抑制率分別為0.83%、3.72%、4.88%、14.40%、31.78%和44.49%，單用GEF(2、4、8及16 μmol·L－1)干預其抑制率分別為 27.16%、34.24%、50.18% 和66.42%，而相同條件下各濃度的CUS和GEF兩兩組合聯用的抑制率均大于藥物相應濃度單用的抑制率，計算得q＞0.85(Tab 1)，提示CUS聯合GEF呈相加作用，初步可見CUS與GEF聯合應用作用優于單藥作用，而且在較大濃度范圍內均有相加作用。

Tab 1 Proliferation inhibition of CUS combined with GEF in BxPC-3 cells(±s，n=4)

Tab 1 Proliferation inhibition of CUS combined with GEF in BxPC-3 cells(±s，n=4)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs the same concentration of GEF alone; IR:Inhibition rate

CUS/ μmol·L－1 GEF/ μmol·L－1 IR/% q valueSynergistic grade 0 0 0 0 0.99 + 2 27.16±1.52 0 4 34.24±2.54 0 8 50.18±1.67 0 16 66.42±0.49 0.0078125 0 0.30±0.03 0.0078125 2 27.74±1.16 1.01 + 0.0078125 4 36.04±0.80 1.05 + 0.0078125 8 50.85±2.10 1.01 + 0.0078125 16 68.12±0.47* 1.02 + 0.015625 0 3.72±1.78 + 0.015625 2 29.69±2.23 0.99 + 0.015625 4 38.00±2.09 1.04 + 0.015625 8 50.88±2.66 0.98 + 0.015625 16 70.29±2.98* 1.04 + 0.03125 0 4.88±1.51 + 0.03125 2 31.21±1.71* 1.02 + 0.03125 4 39.52±0.80* 1.06 + 0.03125 8 52.95±1.10* 1.01 + 0.03125 16 70.29±0.64＊＊ 1.03 + 0.0625 0 14.40±3.43 + 0.0625 2 38.46±1.32＊＊ 1.02 + 0.0625 4 43.63±1.29＊＊ 1.00 + 0.0625 8 54.03±1.25* 0.94 + 0.0625 16 72.30±1.91* 1.01 + 0.125 0 31.78±1.66 + 0.125 2 44.07±0.74＊＊ 0.88 + 0.125 4 49.24±0.25＊＊ 0.90 + 0.125 8 58.19±0.69＊＊ 0.89 + 0.125 16 77.26±3.85* 1.00 + 0.25 0 47.10±0.56 + 0.25 2 55.56±0.77＊＊ 0.90 + 0.25 4 58.80±1.38＊＊ 0.90 + 0.25 8 63.68±1.37＊＊ 0.86 + 0.25 16 81.38±1.42＊＊

2.2 CUS與GEF聯合應用對BxPC-3細胞集落形成的抑制作用 單用0.03125和0.0625 μmol·L－1CUS干預BxPC-3細胞時其集落形成抑制率分別為23.93%和29.45%，而單用2、4及8 μmol·L－1GEF時集落形成抑制率分別為13.50%、24.54%和36.81%;各濃度CUS聯合GEF應用時的集落形成抑制率均分別大于各藥單用時的抑制率，按金氏公式計算得到q＞1.15，協同效果為增強(Tab 2)。

Tab 2 Colony formation rates of BxPC-3 cells after intervention of CUS combined with GEF(±s，n=4)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs the same concentration of GEF;IR:Inhibition rate

CUS/ μmol·L－1 GEF/ μmol·L－1 Colony formation IR/% q valueSynergistic grade 0 0 0 0 1.31 ++ 2 13.50±3.87 0 4 24.54±2.94 0 8 36.81±6.07 0.00391 0 23.93±4.05 0.00391 2 41.72±3.50＊＊ 1.22 ++ 0.00391 4 50.92±9.20* 1.20 ++ 0.00391 8 60.74±2.02＊＊ 1.17 ++ 0.0078125 0 29.45±6.63 0.0078125 2 46.01±4.79＊＊ 1.18 ++ 0.0078125 4 55.83±7.73＊＊1.19 ++ 0.0078125 8 72.39±6.26＊＊

2.3 Western blot檢測CUS聯用GEF對人胰腺癌BxPC-3細胞EGFR蛋白表達水平的影響 結果如Fig 1所示，GEF(8 μmol·L－1)對BxPC-3細胞EGFR蛋白表達量沒有明顯影響，CUS組(0.25 μmol·L－1)BxPC-3細胞的EGFR蛋白表達量已有明顯減少，而CUS(0.25 μmol·L－1)聯合GEF(8 μmol·L－1)干預組BxPC-3細胞的EGFR蛋白表達量減少則更為明顯。從各組EGFR和內參(Actin)條帶的灰度值比值，用金氏公式計算得 q值為2.06，說明 CUS聯合 GEF對胰腺癌BxPC-3細胞EGFR蛋白表達的抑制具有明顯增強的協同效果。

3 討論

以EGFR為靶點的腫瘤治療，主要為抗EGFR的靶向治療藥物，如單克隆抗體、酪氨酸激酶抑制劑等，目前已有10種以上的EGFR靶向藥物，在針對人類不同癌癥類型的治療方面，已取得了巨大的臨床進展。其中，兩種抗EGFR單克隆抗體(西妥昔單抗和帕尼單抗)以及兩種小分子可逆性EGFR酪氨酸激酶抑制劑(厄洛替尼和吉非替尼)，在一些國家已被批準用于治療轉移性非小細胞肺癌、頭頸部鱗狀細胞癌、結腸癌和胰腺癌［20－21］。但靶向治療藥物在臨床的應用中也存在不足之處，一些研究表明EGFR靶向化療藥物僅能抑制EGFR的酪氨酸激酶活性但不能下調其蛋白表達的水平，具有臨床應用單藥療效不佳及易產生耐藥性等特點。本課題組已經證實了CUS是通過干擾胰腺癌中高表達EGFR的蛋白質翻譯階段而起作用，而EGFR酪氨酸激酶抑制劑則能特異地抑制EGFR的功能。因此本研究我們將探討CUS與EGFR酪氨酸激酶抑制劑聯合作用于人胰腺癌細胞是否能進一步抑制細胞的增殖從而表現出協同抗胰腺癌作用。

Fig 1 EGFR protein level of BxPC-3 cells after intervention of CUS combined with GEF analyzed by Western blot(±s，n=3)

本課題組經前期試驗發現吉非替尼(GEF)較厄洛替尼具有更良好的溶解性及藥物敏感性(IC50GEF=11.2，IC50ER=29.7，P＜0.05)，故選用GEF作為細胞靶向干預的試驗用藥。為了說明聯合用藥的效果，我們采用了一些經典的實驗方法來求證。SRB法中選擇單用CUS和單用GEF以及兩藥聯用，觀察聯合用藥組對BxPC-3細胞生長的影響。結果顯示，與單藥作用相比，聯合的各組抑制率均明顯提高。CUS聯合GEF對BxPC-3細胞的作用效果以相加為主，相比之下低濃度藥物聯合組的q值相對較高，提示低濃度的藥物更適于聯用。以上結果表明低劑量范圍的CUS與GEF聯合是最佳的協同抑制濃度，提示聯用CUS可在提高療效的同時降低GEF的用藥劑量，從而降低GEF近期和遠期的不良反應，對改善預后有著特別重要的意義。另外，我們采用了集落形成實驗檢測CUS與GEF聯用的長期效果，計算集落個數能更直觀地了解BxPC-3細胞的生長情況。結果顯示各濃度的CUS聯合GEF應用時的集落形成抑制率均分別大于兩藥單用時的抑制率，按金氏公式計算得到q＞1.15，呈協同作用。本實驗說明隨著作用時間的延長，CUS與GEF聯用的協同效果更為明顯，提示該兩藥聯合的化療方案具有潛在的臨床應用價值。從Western blot的實驗結果可以看出:CUS(1 μmol·L－1)具有明顯下調BxPC-3細胞EGFR蛋白表達量的作用，這與我們前期的研究結果相吻合［18］;GEF(8 μmol·L－1)下調BxPC-3細胞EGFR蛋白水平不明顯，也證實了GEF僅能抑制EGFR的酪氨酸激酶活性但不能下調其蛋白表達的水平;而CUS(0.25 μmol·L－1)聯合應用GEF(8 μmol·L－1)則表現出了對BxPC-3細胞EGFR蛋白水平更為明顯的下調作用，說明吉非替尼可促進CUS下調BxPC-3細胞EGFR蛋白的表達，兩者具有明顯增強的協同作用(q＞2.0)。

綜上，本研究證實了CUS聯合GEF具有協同抑制胰腺癌細胞生長(低濃度和長時間作用協同效果尤為明顯)及協同下調EGFR蛋白的作用。兩者聯合應用，可分別從蛋白表達水平和蛋白酪氨酸激酶活性兩方面雙重抑制EGFR蛋白，應是兩者具有協同抗胰腺癌作用的重要機制之一。這也為胰腺癌的EGFR的靶向治療提供一個新的思路。

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