白花丹醌對人肝癌細胞HepG2、SMMC-7721增殖及其Bax/Bcl-2、Cyclin D1 mRNA表達的影響

張吉仲，萬 謙，劉 圓

(1.西南民族大學(xué)民族藥物研究院，四川成都 610041;2.成都中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，四川成都 610041)

白花丹是指藍雪科植物白花丹Plumbago zeylanica L.的干燥根、根莖及全草，是東南亞多個國家及其中國常用藥材。在我國，其主要生長于四川、福建、廣西、廣東等地區(qū)，主要具有祛風(fēng)散瘀、解毒殺蟲、消腫止痛等作用［1－2］。白花丹醌(plumbagin)為白花丹的主要活性成分［3］，經(jīng)檢驗其具有廣泛的藥理作用，如抗炎、抗凝等。

目前有細胞實驗表明:白花丹醌對卵巢癌［4］、乳腺癌［5］、胃腸道腫瘤［6］等具有一定的抗腫瘤活性。肝癌為一種人類常見的高度惡性腫瘤，其浸潤和轉(zhuǎn)移能力強，預(yù)后差。

本研究旨在通過體外實驗檢測白花丹醌對人肝癌細胞HepG2和SMMC-7721生長的影響機制，以期研究其對肝癌細胞的抗腫瘤活性。

1 材料

1.1 實驗細胞 HepG2、SMMC-7721，購買自四川大學(xué)法醫(yī)與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所。

1.2 主要藥物及試劑 白花丹醌(本實驗室制備，純度 98%);3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide(MTT):Sigma，M2003，美國;RNA提取試劑盒:MRC，Tri Reagent，美國; DEPC:BBI，加拿大;cDNA合成試劑盒:MBI，RevertAidTMH Minus First Strand cDNA Synthesis kit，立陶宛;熒光定量PCR試劑盒(Qpcr):Roche，F(xiàn)aststart U-niversal SyBr Green Master(Rox)，瑞士。

引物合成:從NCBI網(wǎng)站查得Bax、Bcl-2、Cyclin D1和β-actin的全基因序列;利用軟件Primer Express 3.0設(shè)計引物，設(shè)計時擴增長度選定130 bp，其余參數(shù)選為默認值。各基因的引物序列如Tab 1。

Tab 1 The primer sequences of the detected genes in Qpcr analysis

1.3 主要儀器 細胞培養(yǎng)箱:Thermo Scientific，F(xiàn)orma Series II Water Jacket，美國;臺式高速冷凍離心機:Thermo Scientific，Micro 17R，美國;酶標儀: Thermo Scientific，Multiskan Spectrum，美國;DNA Engine PCR儀:MJ Research，PTC-200，美國;實時熒光定量PCR儀:Bio-Rad，CFX96型，美國;倒置相差顯微鏡:Leica公司，DMI3000B，德國。

2 方法

2.1 檢測白花丹醌對HepG2和SMMC-7721細胞的半數(shù)抑制率(IC50) 以DMSO為溶劑，無菌條件下配制白花丹醌原始溶液，濃度為4.57 g·L－1。分別接種生長良好HepG2、SMMC-7721細胞至96孔板，接種細胞量為1.5×104/孔，接種體積為180 μl/孔，5%CO2，37℃條件中培養(yǎng)過夜。第二天，往各孔中加入白花丹醌原始溶液，使得終濃度分別為0.0457、0.0228、0.0114、0.0057和0.0029 g·L－1，并調(diào)整使得每孔的DMSO溶劑為1%，每個濃度設(shè)7個復(fù)孔，同時設(shè)7個復(fù)孔的陰性對照，陰性對照中只加入DMSO至終濃度為1%。而后，對細胞孔進行顯微照像。然后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

48 h后，首先，對細胞孔進行顯微照像，往各孔中加入20 μL的濃度為5 g·L－1的MTT溶液，然后將96孔板放入細胞培養(yǎng)箱中37℃孵育4h。取出96孔板，棄去每孔中的上清，往每孔中加入150 μl的DMSO，吹打3次。將96孔板置于酶標儀于490 nm度數(shù)。根據(jù)讀數(shù)，利用Excel的相關(guān)統(tǒng)計公式計算IC50。

2.2 檢測白花丹醌對HepG2和SMMC-7721細胞的增殖及凋亡相關(guān)基因(Bax、Bcl-2、Cyclin D1)轉(zhuǎn)錄表達的影響 以2×105/孔的細胞量和3 ml/孔的體積接種HepG2、SMMC-7721細胞于6孔板。24 h后，往實驗孔中加入4.57 g·L－1的白花丹醌原始溶液(由溶劑DMSO配制)至白花丹醌終濃度為0.0057 g·L－1，在對照孔中加入相應(yīng)體積的DMSO使其中DMSO的濃度與實驗孔一致。在5%CO2，37℃下繼續(xù)培養(yǎng)48 h，分別使用RNA提取試劑提取RNA，再使用cDNA合成試劑盒合成cDNA，最后使用Qpcr試劑盒在熒光定量PCR儀上進行熒光定量PCR分析，操作按試劑盒和儀器的說明書進行。2.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件，數(shù)據(jù)以±s表示，采用獨立樣本student's t檢驗分析比較各組間差異。

3 結(jié)果

3.1 白花丹醌抑制HepG2細胞的增殖 顯微照像分析表明:濃度低至0.0057 g·L－1的白花丹醌溶液在與HepG2共培養(yǎng)后能明顯改變細胞形態(tài)，改變后的細胞形態(tài)趨向細胞死亡形態(tài)(Fig 1)。說明白花丹醌抑制HepG2細胞的增殖。

檢測不同濃度的白花丹醌對HepG2細胞增殖的抑制作用，結(jié)果如Tab 2。結(jié)果表明:各個濃度的白花丹醌都對HepG2細胞的生長有抑制，濃度低至0.0057 g·L－1時，仍有53.04%的抑制率。而后，通過利用 Excel軟件分析，計算得出白花丹醌對HepG2的半數(shù)抑制率(IC50)為0.0067 g·L－1。

Fig 1 The microscopic images of HepG2cultured with 1%DMSOor 0.0057 g·L－1plumbagin for 48 h

Tab 2 The inhibitory effect of plumbagin at different concentrations on the proliferation of HepG2

3.2 白花丹醌上調(diào)HepG2細胞的Bax/Bcl-2，下調(diào)Cyclin D1基因的轉(zhuǎn)錄水平 根據(jù)“3.1”所述的結(jié)果，將白花丹醌的干預(yù)濃度選定在0.0057 g·L－1，在該濃度下干預(yù)HepG2細胞48 h。提取被干預(yù)的HepG2細胞的mRNA，接著合成cDNA，進行了QpcR檢測。選擇的被檢測的基因為:(1)細胞凋亡相關(guān)基因 Bax和 Bcl-2;(2)細胞周期相關(guān)基因 Cyclin D1，選擇以β-actin基因作為內(nèi)參基因，檢測結(jié)果如Tab 3。結(jié)果表明:白花丹醌明顯上調(diào)了Bax/Bcl-2比值(P=0.0017)，同時明顯下調(diào)了Cyclin D1基因的轉(zhuǎn)錄水量(P=0.0287)。

Tab 3 Effect of plumbagin on the Bax/Bcl-2 ratio and the transcriptional level of Cyclin D1 gene of HepG2

3.3 白花丹醌抑制SMMC-7721細胞的增殖 顯微照像分析表明:濃度低至0.0057 g·L－1的白花丹醌溶液在與SMMC-7721共培養(yǎng)后能明顯改變細胞形態(tài)，改變后的細胞形態(tài)趨向細胞死亡形態(tài)(Fig 2)。說明白花丹醌抑制SMMC-7721細胞的增殖。

Fig 2 The microscopy images of SMMC-7721 cultured with 1% DMSO or 0.0057 g·L－1plumbagin for 48 h

檢測不同濃度的白花丹醌對SMMC-7721細胞增殖的抑制作用，結(jié)果如Tab 4。結(jié)果表明:各個濃度的白花丹醌都對SMMC-7721細胞的生長有抑制，濃度低至0.0057 g·L－1時，仍有88.48%的抑制率。而后，通過利用Excel軟件分析，計算得出白花丹醌對SMMC-7721的半數(shù)抑制率(IC50)為0.0012 g·L－1。

Tab 4 The inhibitory effect of plumbagin at different concentrations on the proliferation of SMMC-7721

3.4 白花丹醌上調(diào)SMMC-7721細胞的Bax/Bcl-2，下調(diào)Cyclin D1基因的轉(zhuǎn)錄水平 根據(jù)“3.3”所述的結(jié)果，將白花丹醌的干預(yù)濃度選定在0.0057 g ·L－1，在該濃度下干預(yù)SMMC-7721細胞2 d。然后，提取被干預(yù)的SMMC-7721細胞的mRNA，接著合成cDNA，進行了QpcR檢測。選擇的被檢測的基因為:(1)細胞凋亡相關(guān)基因Bax和Bcl-2;(2)細胞周期相關(guān)基因Cyclin D1，選擇以β-actin基因作為內(nèi)參基因，檢測結(jié)果如Tab 5。結(jié)果表明:白花丹醌明顯上調(diào)了Bax/Bcl-2比值(P=0.0104)，同時顯著下調(diào)了Cyclin D1基因的轉(zhuǎn)錄水量(P=0.0165)。

4 討論

白花丹醌是一種小分子萘醌化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為5-羥基-2-甲基-1，4-萘醌(5-hydroxy-2-methyL－1，4-napht--hoquinone)。其最早用于抗動脈粥樣硬化、護肝、強心等。目前大量研究表明其對多種腫瘤細胞系有明顯抑制作用。Bharathi等［6］通過動物實驗研究表明，白花丹醌能夠明顯地抑制氧化偶氮甲烷誘發(fā)的小腸腫瘤;Sandur等［7］的研究表明:白花丹醌有可能是通過抑制NF-kappaB通路而達到抗腫瘤作用;Nair等［8］研究表明:其可通過誘導(dǎo)凋亡增加宮頸癌細胞對放療的敏感性;劉超等［9－10］的研究表明:白花丹醌體外具有抑制人乳腺癌細胞mdamb-231生長的作用。

Tab 5 Effect of plumbagin on the Bax/Bcl-2 ratio and the transcriptional level of Cyclin D1 gene of SMMC-7721

肝癌是我國癌癥死亡的第二大病因，晚期患者中位生存期短，目前的治療方法不能明顯延長生存期。本研究首先以通過顯微照像發(fā)現(xiàn)白花丹醌對人肝癌細胞HepG2和SMMC-7721增殖有抑制，接著，MTT法檢測表明白花丹醌能明顯抑制人肝癌細胞HepG2和SMMC-7721的增殖，發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度增加，細胞存活率下降，而且對兩種細胞的IC50都低于0.0100 g·L－1。實驗還發(fā)現(xiàn)，白花丹醌對SMMC-7721的抑制作用大于對HepG2的作用，其原因?qū)⒃谙乱徊窖芯恐刑骄俊？偠灾鲜鼋Y(jié)果表明白花丹醌能有效抑制兩種肝癌細胞的增殖。

通過對白花丹醌抑制機制的探討，發(fā)現(xiàn)其上調(diào)了HepG2和SMMC-7721的Bax/Bcl-2的比值，同時下調(diào)了Cyclin D1的轉(zhuǎn)錄水平。Bax/Bcl-2是凋亡相關(guān)指數(shù)［11］，其數(shù)值越高說明凋亡趨勢越明顯。Cyclin D1是細胞周期蛋白質(zhì)，其含量隨細胞周期的進展而變化，在G1/S交界區(qū)含量最高［12］，由于培養(yǎng)細胞的細胞周期不同步，所以總有部分細胞處于G1/S交界區(qū)，所以Cyclin D1總能被檢測到，同時，其檢測出來的含量能初步反映整個細胞群的增殖活躍的程度。上述結(jié)果闡明了白花丹醌對兩種肝癌細胞增殖抑制的機制。

綜上所述，白花丹醌能有效抑制人肝癌細胞的增殖，其機制與Bax/Bcl-2比值的上調(diào)和Cyclin D1轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào)有關(guān)，說明白花丹醌具有抗肝癌的作用。

［1］ 郭曉莊.有毒中草藥大辭典［M］.天津:天津科技翻譯出版公司，1992:177.

［1］ Guo X Z.The Dictionary of Toxic Chinese Herbs［M］.Tianjin: The Translation Publishing House of Science and Technology of Tianjin，1992:177.

［2］ 譚明雄，王恒山，陳振鋒，等.白花丹化學(xué)成分和藥理活性研究進展［J］.中草藥，2007，38(2):289－93.

［2］ Tan M X，Wang H S，Chen Z F，et al.The progress of the research of the chemical components and pharmacological activities of plumbago zeylanica［J］.Chin Herb Med，2007，38(2):289－93.

［3］ 劉 圓，劉 超.RP-HPLC法測定不同采收期白花丹中白花丹醌［J］.中草藥，2007，38(8):1258－9.

［3］ Liu Y，Liu C.The measurement of plumbagin in plumbago zeylanica collected in different times with RP-HPLC assay［J］.Chin Herb Med，2007，38(2):1258－9.

［4］ Thasni K A，Ratheeshkumar T，Rojini G，et al.Structure activity relationship of plumbagin in BRCA1 related cancer cells［J］.Mol Carcinog，2012 Jan 30.doi:10.1002/mc.21877［Epub ahead of print］

［5］ Kanjoormana A M，Muthu K S，Peramaiyan R，et al.Plumbagin inhibits invasion and migration of breast and gastric cancer cells by downregulating the expression of chemokine receptor CXCR4［J］.Mol Cancer，2011，10:107－12.

［6］ Bharathi R S，Gayathri S，Sakeena S M，et al.Apoptosis inducing effect of plumbagin on colonic cancer cells depends on expression of COX-2［J］.PLoS ONE，2011，6(4):e18695－701.

［7］ Sandur S K，Ichikawa H，Set hi G，et al.Plumbagin(5-hydroxy-2-methyL－1，4-naphthoquinone)suppresses NF-kappaB activation and NF-kappaB-regulated gene products through modulation of p65 and IkappaBalpha kinase activation，leading to potentiation of apoptosis induced by cytokine and chemotherapeutic agents［J］.Biol Chem，2006，281(25):17023－331.

［8］ Nair S，Nair R R，Srinivas P，et al.Radiosensitizing effects of plumbagin in cervical cancer cells is through modulation of apoptotic pathway［J］.Mol Carcinog，2008，47(1):22－33.

［9］ 劉 超，劉 圓，顏曉燕.白花丹醌對人乳腺癌細胞mda-mb-231的體外效應(yīng)［J］.華西藥學(xué)雜志，2008，23(1):42－4.

［9］ Liu C，Liu Y，Yan X Y.Analyze the efficiency of Plumbagin on the human breast cancer cells mda-mb-231［J］.West China J Pharm Sci，2008，23(1):42－44.

［10］張吉仲，劉 圓，焦 濤.白花丹不同有機溶劑提取物和白花丹醌對移植性乳腺癌和S180肉瘤的作用［J］.中國藥理學(xué)通報，2008，24(8):1040－3.

［10］Zhang J Z，liu Y，Jiao T.Antitumor activity of different organic solvents extracts and plumbagin from plumbago zeylanica on EMT-6 breast cancer and transplanting S180 in vivo［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(8):1040－3.

［11］Salakou S，Kardamakis D，Tsamandas A C，et al.Increased Bax/ Bcl-2 ratio up-regulates caspase-3 and increases apoptosis in the thymus of patients with myasthenia gravis［J］.In Vivo，2007，21 (1):123－32.

［12］John P A.The regulation of cyclin D1 degradation:roles in cancer development and the potential for therapeutic invention［J］.Mol Cancer，2007，6:24－30.