重組人角質細胞生長因子-2對實驗禿毛大鼠的毛發再生作用

王 澤，黃鵬煌，趙海洋，李海燕，田海山，4，李校堃1，，4

(1.吉林農業大學生物反應器與藥物開發教育部工程研究中心，吉林長春 130021;2.溫州醫學院藥學院，浙江溫州 325035; 3.吉林農業大學生命科學學院，吉林長春 130021;4.浙江格魯斯特生物科技有限公司，浙江溫州 325000)

角質細胞生長因子-2(keratinocyte growth factor-2，KGF-2)由成纖維細胞和其它間充質來源的細胞分泌，能與表達于上皮細胞的激酶受體FGFR1Ⅲb和FGFR2Ⅲb相結合，通過間質-上皮細胞相互作用的旁分泌方式發揮作用，特異性促進上皮細胞的增殖、分化和遷移［1－2］。KGF-2與受體FGFR2Ⅲb的親和力很高，是其特異性配體。KGF-2與受體結合后，促使受體處于細胞內的C端酪氨酸殘基磷酸化，磷酸化的受體具有酪氨酸蛋白激酶活性，并與一系列靶蛋白發生作用。其專一靶細胞是表皮細胞，能刺激所有皮膚內的表皮基本單位包括毛囊、皮脂腺、汗腺生長［3，4］。

表皮毛囊生長受間質和上皮細胞相互作用的調節，使其經歷生長期、退化期和終期的循環［5］。在循環中最主要的動力是毛囊的間充質，尤其是真皮乳突細胞。上皮干細胞，存在于毛囊的凸起部位，可以對來自真皮乳突細胞的感應信號產生反應［6］，對感應信號的反應可以刺激干細胞在毛囊凸起部位的增殖，然后子代干細胞向下生長至真皮深處，于此同時毛母質細胞開始生長并且復雜的毛囊結構開始形成。

KGF-2在真皮乳突細胞中被發現，并且它的受體FGFR2Ⅲb在角蛋白細胞毗鄰的外根鞘中被發現［7］。KGF-2是毛囊細胞間質衍生的刺激物。10 μg·L－1的KGF-2就可以刺激培養的人毛囊細胞明顯的生長［8］。因此，KGF-2有望成為刺激人毛發生長的治療劑。但目前對KGF-2在促進毛發生長方面的研究只限于細胞水平，本實驗著重在動物水平上證明KGF2能夠刺激毛發再生。

目前的治療藥物主要為化藥、中藥、保健品、洗發、護發素類，尚未有基因工程藥物應用于臨床。在本項研究中，KGF-2在治療人的脫發疾病上有望成為促進毛發生長的藥劑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及藥品 重組人角質細胞生長因子-2凍干粉(浙江省生物制藥重點實驗室制備);SD大鼠，體質量200 g左右，♂，60只，清潔級(溫州醫學院實驗動物中心);重組人酸性成纖維細胞生長因子(浙江省生物制藥重點實驗室制備);5%米諾地爾酊(商品名:蔓迪，浙江萬馬藥業)。

1.1.2 主要試劑及儀器 小動物活體成像儀(美國CRi公司);0.9%氯化鈉注射液(浙江康樂藥業);怡美寧異氟烷(山東科源制藥有限公司);小動物專用吸入麻醉機(北京吉安得爾科技有限公司);薇婷脫毛膏(印度利潔時公司);光學顯微鏡(日本Nikon公司);石蠟包埋機(美國Thermo公司);石蠟切片機(美國Thermo公司);電子分析天平(瑞士MettlerToledo 公 司);CO2培 養 箱 (Thermo CELLBB15);二甲基亞砜DMSO(Gibco)

1.2 方法

1.2.1 四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)測定rh-KGF2活性 收集培養至對數期的NIH3T3細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入100 μl，接種于96孔細胞培養板中，使待測細胞密度為5 000～10 000個/孔。37℃、5%CO2培養箱中孵育至細胞貼壁，大約24 h。倒掉原培養液，換饑餓培養基(低糖DMEM+ 0.5%FBS)，每孔100 μl，饑餓培養18 h。加入100 mg·L－1的rhKGF2樣品溶液，每孔100 μl，設3個復孔，進行2倍梯度稀釋，共7個稀釋度。另選3個復孔加饑餓培養基做陰性對照，每孔100 μl。37℃、5%CO2培養箱中孵育48 h。每孔加入25 μl MTT溶液(5 g·L－1)，繼續培養4 h。倒掉液體，每孔加150 μl二甲基亞砜，混勻后，放入酶標儀OD 570 nm (630 nm校準)測量各孔的吸光值，記錄測定結果。

1.2.2 實驗動物模型建立 參考文獻報道方法［9］建立動物模型，大鼠經異氟烷吸入麻醉后，在其背部制作(4×3)cm2的脫毛區，先用寵物推剪將實驗區毛發推短至3～5 mm，再涂抹脫毛膏，作用3 min后用刮匙輕輕(以免損傷皮膚)刮去毛發，再用純凈水清洗實驗區，除去殘余的脫毛膏。

1.2.3 實驗動物分組 造模次日，選取造模成功的大鼠，利用SPSS 18.0統計軟件根據初始體重進行隨機分組，即正常對照組、5%米諾地爾組(50 g· L－1)、aFGF組(4 mg·L－1)、rhKGF2高(100 mg· L－1)、中(50 mg·L－1)、低(10 mg·L－1)劑量組、0.9%生理鹽水組。每組大鼠8只。

1.2.4 實驗動物給藥 每日給藥1次(正常對照組除外)，連續給藥14 d。每次給藥前先用75%酒精進行實驗區常規消毒，再用0.5 mm的滾針在實驗區來回滾3次(5%米諾地爾組除外)，最后用無菌棉棒進行實驗區皮膚涂抹給藥。5%米諾地爾組每次涂抹1 ml，aFGF組、rhKGF2高、中、低劑量組、0.9%生理鹽水組每次涂抹300 μl。

1.2.5 實驗動物體重記錄 以給藥第1、5、9、14天為主要觀察、記錄時間點，稱量各組大鼠的體重并記錄。

1.2.6 實驗動物脫毛區毛長記錄 以給藥第1、5、9、14天為主要觀察，記錄時間點，拔取脫毛區最長毛8根，放大鏡下用游標卡尺測定長度，并計算平均值，作為各大鼠脫毛區新生毛的長度，再計算每組大鼠毛發均值。

1.2.7 實驗動物脫毛區毛發生長狀況觀察 以給藥第1、5、9、14天為主要觀察、記錄時間點，對大鼠背部脫毛區進行照相機拍照記錄(正常對照組除外)。

1.2.8 實驗動物脫毛區毛重記錄 于給藥第14天刮取大鼠脫毛區全部體毛，用萬分之一電子分析天平稱重，作為各大鼠脫毛區新生毛的重量，再計算每組大鼠毛重均值(正常對照組除外)。

1.2.9 實驗動物脫毛區皮膚組織病理學檢查 于給藥第14天處死大鼠，切取各組(正常對照組除外)大鼠背部脫毛區相同位置皮膚組織塊，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，切片厚約7 μm，HE染色，光學顯微鏡下觀察。

1.3 統計學分析 采用SPSS 18.0統計軟件對所得數據進行統計學處理，所有數據均以±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析檢驗。

2 結果

2.1 rhKGF2活性測定結果 rhKGF2處理NIH3T3細胞48 h后，在1～100 mg·L－1之間rh-KGF2對NIH3T3細胞有明顯的促進增殖作用，呈現出良好的蛋白活性，且呈現劑量－效應關系。結果見Fig 1。

2.2 實驗動物模型建立成功 造模次日，觀察大鼠背部脫毛區皮膚，表面光滑，無過敏、紅腫、損傷現象出現，提示造模成功。

2.3 給藥第1、5、9、14天實驗動物體重變化 實驗結果顯示，與正常對照組相比，各組體重均呈現正常增長趨勢，差異無顯著性(P＞0.05)。說明各組受試藥品對實驗大鼠的正常生長無影響。結果見Fig 2。

2.4 給藥第1、5、9、14天實驗動物脫毛區毛發生長長度變化 實驗結果顯示，給藥前各組大鼠背部脫毛區毛發均被全部去除(正常對照組除外)。在給藥第5、9、14天，與正常對照組相比，0.9%生理鹽水組毛發長度變短，差異有顯著性(P＜0.01);在給藥第5、9天，與0.9%生理鹽水組相比，rhKGF2高、中劑量組差異有顯著性(P＜0.05，P＜0.01)，rhKGF2低劑量組無顯著性差異(P＞0.05)，5%米諾地爾組、aFGF組存在顯著性差異(P＜0.01);在給藥第14天，與0.9%生理鹽水組相比，rhKGF2高、中、低劑量組差異有顯著性(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05)，5%米諾地爾組、aFGF組差異有顯著性(P＜0.01，P＜0.01)。結果見Fig 3。

Fig 1 rhKGF2 stimulated NIH3T3 cell proliferation assay

Fig 2 Body weight of the experimental SD rats(±s，n=8)

2.5 給藥第14天實驗動物脫毛區毛發重量變化實驗結果顯示，在給藥第14天，與0.9%生理鹽水組比較，5%米諾地爾組、aFGF組、rhKGF2高、中、低劑量組均差異有顯著性(P＜0.01)。結果見Fig 4。

2.6 給藥第1、5、9、14天實驗動物脫毛區毛發生長狀況 實驗結果顯示，在給藥第1天，各組大鼠脫毛區皮膚光滑、紅潤，無紅腫、損傷現象出現，無殘損毛發存在;在給藥第5天，各組大鼠脫毛區毛發均呈現生長狀態，5%米諾地爾組、rhKGF2中劑量組、aFGF組呈現較為明顯，并且毛發生長密度均勻;在給藥第9天，可見5%米諾地爾組、rhKGF2中劑量組、aFGF組明顯變長，并且毛發生長密度變大。rhKGF2高劑量組也呈現明顯的生長狀態;在給藥第14天，可見5%米諾地爾組、rhKGF2中劑量組、aFGF組已基本恢復到正常毛發長度水平，rhKGF2高、低劑量組和0.9%生理鹽水組毛發生長狀態明顯，但毛發密度不均。需要注意的是，rhKGF2高、低劑量組之間并無明顯差異，但中劑量組較高、低劑量組而言，效果明顯。結果見Fig 5。

Fig 3 Hair length of the experimental rats(±s，n=8)

Fig 4 Hair weight of the experimental rats(±s，n=8)

Fig 5 Hair growth conditions of the experimental rats

2.7 給藥第14天實驗動物脫毛區皮膚組織病理學檢查 組織病理切片結果顯示，在100倍光鏡下，給藥第14天，5%米諾地爾組、aFGF組、rhKGF2中劑量組真皮及皮下組織中可見大量新生毛囊及新生的內毛根鞘，無毛囊萎縮變小現象，膠原纖維正常，無炎癥細胞浸潤，并且毛囊向下生長至皮下，趨于成熟。真皮厚度已由毛發快速生長期(變厚)恢復到正常水平。rhKGF2高、低劑量組真皮及皮下可見較多新生毛囊，并且在真皮及皮下的交界處有大量毛囊，說明毛囊處于新生到成熟的過渡狀態，還未成熟，真皮厚度由毛發快速生長期(變厚)向正常水平恢復(未恢復到正常厚度)。0.9%生理鹽水組真皮處可見大量新生毛囊，真皮厚度處于最厚階段(毛發快速生長期)。結果見Fig 6。

Fig 6 Taking the experimental skin for histopathological examination(HE×100)

3 討論

毛發疾病特別是斑禿，困擾著無數的患者，它所帶來的心理壓力遠遠大于疾病本身，雖有很多宣傳治療脫發的產品，但大多數均為衛消字、衛健字、衛妝字、衛食字等產品，其效果往往難以保證，甚至會對治療者產生不良反應。美國開發了第一個治療脫發疾病的外用化學藥品－米諾地爾溶液，并獲得了FDA的批準，成為目前唯一被批準治療脫發的OTC藥物。該藥物經頭皮吸收后可以擴張頭皮下血管，改善毛囊周圍的微循環［10］，減少毛囊周圍的炎癥細胞浸潤，延緩上皮基質細胞的衰老，從而使萎縮的毛囊肥大并促進毛發的生長［11］。

近來研究發現，許多生物活性物質，如角質細胞生長因子-2(KGF-2)、神經生長因子(NGF)、表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)等對毛發生長有明顯的調節作用，已成為該領域研究的熱點［12］。

本實驗以5%米諾地爾溶液為陽性藥物，比較rhKGF2對毛發生長的作用效果，但是米諾地爾為化學類藥物，而rhKGF2為蛋白類藥物，二者之間存在著本質的差別，所以在本實驗中又設立了aFGF(4 mg·L－1)［13］陽性藥物組，以便更充分的說明 rh-KGF2對毛發生長的作用效果。

與正常對照組比較，本研究中各組大鼠體重差異無顯著性(P＞0.05)，均呈現正常生長趨勢，一定程度上說明受試藥品對動物的正常生長不存在明顯影響。由實驗結果可知，rhKGF2高、中、低劑量均對實驗大鼠的毛發生長有作用，以中劑量最為明顯。rhKGF2高劑量與低劑量二者之間比較，在毛發生長方面的作用效果近似相同，而中劑量與二者比較卻效果顯著，說明rhKGF2高劑量(100 mg·L－1)有可能是rhKGF2作用于毛發生長的退行期劑量，另外本實驗從實驗結果中推測中劑量(50 mg·L－1)到高劑量(100 mg·L－1)之間可能還存在比中劑量(50 mg·L－1)作用效果更好的劑量或平臺期劑量，有待進一步實驗確認。rhKGF2中劑量組在毛發生長長度和毛發重量方面與5%米諾地爾組和aFGF組相比，數據統計上雖差異無顯著性，但由實驗結果可見，rhKGF2在毛發再生的作用效果上與5%米諾地爾(陽性藥物)相當，略強于aFGF(陽性藥物)。病理切片結果顯示，在促進毛囊新生與成熟方面，rhKGF2也表現較好的作用效果，并且不會引起皮膚病變。推測rhKGF2促進毛發生長的機制是由于刺激毛囊干細胞、毛母質細胞的增殖與分化，并在一定程度上刺激毛囊上皮細胞的增殖與分化，從而促進毛囊的新生與成熟。

本實驗為基因工程蛋白類藥物rhKGF2作為應用于臨床治療脫發的候選藥物提供了有力依據。可以開發成為比化學類藥物更為安全的新一代治療禿發的產品。

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