不同宿主來源犬瘟熱病毒的分離及致病相關基因序列分析

李天松，王 磊，王勝樂，姜 雪，許微微，李元果，高玉偉，3，王鐵成，3，黃 耕，3，夏咸柱，3

（1.吉林農業大學動物科學技術學院，吉林 長春 130118；2.中國人民解放軍軍事醫學科學院軍事獸醫研究所，吉林 長春 130122；3.吉林省人畜共患病預防與控制重點實驗室，吉林 長春 130122）

犬瘟熱（CD）是由犬瘟熱病毒（CDV）引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病［1］，是目前國內外犬、貂、狐貍等經濟動物的主要傳染病之一，常造成巨大經濟損失。CDV致病性相關的蛋白主要是V蛋白、F蛋白。V蛋白能干擾干擾素（Interferon，IFN）通路，促進病毒對宿主的逃逸［2］。F蛋白誘導膜融合，其先以無活性的前體F0形式存在，被宿主蛋白水解酶裂解［3－5］成信號肽、F1、F2亞單位［6］。F1亞單位包括幾個在促進膜融合中有重要作用的區域：跨膜區（TM）、胞質尾區（CT，20～40殘基）、融合肽（FP）-在所有的CDV毒株中高度保守。此外，F1還包括兩個七價重復區：HRA、HRB［7］。本試驗從我國CDV發病死亡犬、狐貍體內分離到4株病毒，基因進行克隆及測序后對其V基因、F基因進行分析，報告如下。

1 材料與方法

1.1 病料樣品 樣品來自于自然發病死亡藏獒（TM）、四川犬、濰坊狐貍、松源狐貍，臨床表現為發熱，血便，食欲減退，鼻內有水樣液體流出，眼角有分泌物，皮膚有少量皮疹。剖檢留肺臟、脾臟、腸等器官，－70℃保存備用。

1.2 載體、感受態細胞及相關試劑 載體p EASYT Simple Vector及DH5α感受態細胞、pfu高保真DNA聚合酶及d NTP，購自北京全式金生物技術有限公司；質粒小量提取試劑盒、凝膠回收試劑盒，購自AXYGEN公司；AMV反轉錄酶，購自Sigma公司；RNA提取試劑盒，購自Bio Flux；FITC標記的羊抗鼠二抗，購自北京中杉金橋生物技術有限公司；抗CDV單克隆抗體由本實驗室制備；其他試劑，購自Ta KaRa公司。

1.3 細胞 Vero-DST（Vero-DogSLAMTag）細胞，由本實驗室構建及保存。DMEM，購自Gibco公司，細胞培養瓶，購自于Costar公司。

1.4 病料的處理 －70℃取出肺及脾，稱重后冰上研磨至勻漿，按重量體積比1∶10加入無血清的含有1 000 IU／m L雙抗的DMEM繼續研磨約3 min。傾出勻漿液4℃3 000 r／min離心10 min，5 000 r／min離心10 min，無菌吸出上清備用。

1.5 細胞培養 Vero-DST 75 cm2瓶內長成單層，加入病料上清液2 m L，33℃感作1 h后加入20 m L含有2%犢牛血清的DMEM，37℃培養，每天觀察細胞病變，如無病變第5天凍融收毒再接Vero-DST細胞。如此傳代至第5代用于鑒定及序列測定。

1.6 病毒鑒定

1.6.1 電鏡檢查 取第5代Vero-DST細胞毒200 μL 1 000 r／min離心10 min后取上清進行電鏡檢查。1.6.2 間接免疫熒光鑒定及TCID50測定 Vero-DST消化計數，調整為2×105個／m L按100μL／孔鋪96孔板。培養12 h棄上清接種10倍連續稀釋的猴、犬Vero-DST第5代毒，每個稀釋度接4個孔，100μL／孔，37℃培養5 d。以抗CDV單克隆抗體為一抗、FITC標記的羊抗鼠抗體為二抗（含0.3%伊文斯藍）進行間接免疫熒光鑒定，以陽性孔算為病變孔按Reed-Muench方法TCID50。

1.6.3 PCR鑒定、引物設計及合成 PCR鑒定引物根據CDV N基因保守區設計并由Ta KaRa公司合成，目的片段大小為477 bp，引物序列：CDV-F：5′-GTGACTGCTCCTGATACTGC-3′、CDV-R：5′-ACCAACTCCCATAGCATAAC-3′。病 毒 液 提 取CDV基因組并反轉錄并鑒定，設陽性及陰性對照。1.6.4 5株CDV分離毒的V基因、F基因序列克隆及測定 根據GenBank上發表的強毒株A75／17（AF164967.1）序列設計引物，全基因共分為17段進行PCR，電泳回收陽性片段并連接p EASY-T Simple載體，轉化TOP10感受態細胞后涂于Amp＋LB平板，挑取10個菌落于5 m L 2倍Amp＋的LB液體培養基37℃搖均，12 h用AXYGEN公司質粒小提試劑盒提取質粒，陽性質粒送TaKaRa公司測序，每個片段送5個樣。測序結果拼接后將V、F蛋白 氨 基 酸 序 列 與 5804（AY386315.1）、A75／17（AF164967.1）、Onderstpoort（AF014953.1）、CDV3（EU726268.1）、Snyder Hill（GU138403.1）等共20多株強毒株、疫苗株進行比較，分析5株CDV與參考毒株之間的V、F蛋白氨基酸衍化特征。

2 結果

2.1 病毒分離及鑒定結果 所有病毒接種Vero－DST培養至第5代并無明顯細胞病變產生（見圖1 B），細胞形態與對照細胞（見圖1 A），略有差異。5d后收毒，細胞凍融物電鏡檢測可見有典型的副黏病毒樣顆粒，形態呈圓形和多形性（見圖2），由此可初步確定分離到犬源和狐貍源CDV，并命名為CDVTM-CC、CDV-Dog-SCh、CDV-Fox-SY、CDV-Fox-WF。

以CDV-TM-CC與 CDV-Fox-WF為代表進行間接免疫熒光鑒定，Vero-DST細胞對照在熒光顯微鏡下全部細胞均為紅色（見圖3A）。而低稀釋倍數接毒細胞可見有散在發綠色的細胞，個別細胞內可見有多個核，形成多核巨細胞（見圖3B、圖3C）。熒光分布顯示沒有大面積的熒光團，故在光鏡下沒有形成肉眼可見的細胞病變。計算CDV-TM-CC TCID50為 103.5／m L，CDV-Monkey-BJ TCID50為102.5／m L。

4株分離毒與本實驗室保存的猴源CDV-Monkey-BJ提取 RNA，經反轉錄，特異引物鑒定按CDV-Monkey-BJ、CDV-TM-CC、CDV-Dog-SCh、CDV-Fox-SY、CDV-Fox-WF順序進行電泳，結果可見5株病毒、陽性對照在500 bp左右有明顯的條帶，大小一致，而三餾水陰性對照無條帶（見圖4），因此PCR結果為陽性。

由上述數據可證實，用Vero-DST細胞系分離到4株猴源CDV病毒，病毒在Vero-DST細胞上傳5代沒有形成細胞病變。

圖4 5株細胞毒PCR鑒定結果

2.2 F蛋白序列分析 CDV-TM-CC、CDV-Monkey-BJ、CDV-Dog-SCh、CDV-Fox-WF和CDV-Fox-SY F蛋白分析，可見5株與強毒株氨基酸同源性在93.8%～99.1%，而與弱毒株同源性在90.4%～93%之間，因此5株分離毒與強毒株的親緣關系較近。分析F蛋白內部可見信號肽與F1、F2相比變異較大，13～37位、72～112位之間氨基酸變化最大，有多處存在連續3個氨基酸不同。疫苗株有27個特有氨基酸，在這27個位點5株與其完全不同。108～110位的NAT潛在N-糖基化位點為強毒株和5株分離株所共有，疫苗株沒有（見圖5）。

F2區域內208K、216L和 F1區域：390F、431I、616S（位于TM區）、646A（位于CT區）是疫苗株共有4個特有的氨基酸位點。CDV-TM-CC、CDVMonkey-BJ、CDV-Dog-SCh、CDV-Fox-WF and CDV-Fox-SY在這6個位點與強毒株一致。此外，CDV-Monkey-BJ還有7個特有位點：317R、347I、465I、466T、471P、472W、586N，全部集中于F1片段上，這可能是其引起猴發病的分子基礎。F1、F2區域共有4個潛在N－糖基化位點：141～143 NLS、173～175 NVS、179～181 NCT、517～519 NQS，前三者位于F2亞基內，NQS位于F1亞基內。HQS位于F1亞基內。

在二硫鍵形成和蛋白的空間構型中半胱氨酸（C）起著主要的作用。本試驗所分離到的5株CDV F蛋白與強毒株、疫苗株均有17個半胱氨酸殘基，且為強毒株與疫苗株共有。因此空間構型上強毒株與弱毒株可能一致。

2.3 V蛋白分析 V蛋白與CDV的毒力有關，強毒株的V基因可干擾宿主干擾素（IFN）通路，從而有利于CDV的宿主逃逸。5株Vero-DST V基因與參考毒株氨基酸序列分析表明，其與強毒株同源性在92%～99.7%之間，與疫苗株的同源性在89.3%～93.3%之間，V蛋白疫苗株與強毒株共有9個位點是完全不一致的CDV-Monkey-BJ在這9個位點上完全與強強株一致，說明本株毒與強毒株親緣關系較近。

對比麻疹病毒（Measles virus）與CDV的V蛋白，272位存在C／R的差異，用swiss-model網站進行C272R突變同源蛋白空間構象模擬，結果顯示，結合Zn分子的能力下降（見圖6）。這對下一步CDV V基因的研究提供理論依據。

圖6 V蛋白C272R突變空間構象模擬

3 結論與討論

利用本實驗室構建的Vero-DST細胞系分離到4株CDV 并命名為 CDV-TM-CC、CDV-Dog-SCh、CDV-Fox-WF 和 CDV-Fox-SY。 在 Vero-DST 細胞上傳到5代病毒并不形成細胞病變，10代以后產生細胞病變，通過后續的研究中發現，CDV-TM-CC株10代與5代在F基因內存在三個氨基酸位點差異，這三個位點可能與細胞病變形成有關。

V蛋白、F蛋白是與CDV致病性相關的兩個主要蛋白，F蛋白在病毒的入侵及細胞之間的傳播是至關重要，5株病毒分析結果顯示，CDV-Monkey-BJ F1區域內有7個特有位點：317R、347I、465I、466T、471P、472W、586N，這些位點可能與其能引起靈長類動物發病有關。值得關注的是586N位于HRB內，而HRB在膜融合過程中參與6螺旋體的形成［8］。F2、F1亞基內潛在 N-末端糖基化位點5株病毒與參考序列一致，這比Sultan等［9］2009報道的部分AisaⅡ型毒株少一個糖基化位點，因此其抗原性可能與其有差異。

V蛋白可干擾IFN通路中部分因子的磷酸化及其向核內轉移，因此在CDV抗宿主干擾素作用中起關鍵性作用。V蛋白序列分析表明，5株CDV與強毒株親緣關系較近，同源性為94%～99.7%。國外學者報道V蛋白110Y、272C兩個位點在抗宿主IFN作用中起到關鍵作用［10－11］。本試驗對CDVMonkey 5代毒V蛋白序列進行空間構象同源模擬也證實C272R突變使其失去Zn結合能力下降，從而改變鋅指結構的空間穩定性。

綜上所述，本試驗分離到4株CDV，并將其命名 為 CDV-TM-CC、CDV-Dog-SCh、CDV-Fox-SY、CDV-Fox-WF株，其在V蛋白、F蛋白與強毒株親緣關系較近。后續通過雪貂試驗證實其確為強毒株，但其對犬、猴的致病性如何還需進一步試驗。

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