內毒素對肉雞腸黏膜及肝線粒體復活體Ⅰ活性的影響及氨基胍的保護效應

王 巖，石冬梅，向瑞平，皇甫和平，張 華，唐兆新，徐家華，王友令，張 勝

（1.鄭州牧業(yè)工程高等專科學校，河南 鄭州 450011；2.華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣東 廣州 510642）

內毒素 （endotoxin）是指革蘭陰性細菌細胞壁外膜的脂多糖 （lipopolysaccharide，LPS）成分［1］。在獸醫(yī)臨床中，由于抗生素或補體復合物的大量使用，使大腸桿菌、沙門菌等革蘭陰性菌死亡裂解，釋放出內毒素［2］。內毒素脂多糖（LPS）可引起組織缺血，改變溶酶體內過氧化物及線粒體內細胞色素氧化酶系統(tǒng)，消耗大量ATP，使鈣泵活性下降，并阻礙呼吸鏈的傳遞，介導質子過氧化反應，促進氧自由基的形成，進一步損傷細胞膜結構［3］。內毒素血癥是導致革蘭陰性桿菌病抗生素治療失敗和家禽業(yè)重大經濟損失的主要原因之一［4］。因此，闡明其發(fā)病機制，尋找有效的防治方法具有重要的現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 試驗動物分組與處理 本試驗所用嶺南黃羽肉雞，均購自廣東省畜牧研究所孵化廠，自由采食和飲水，至30日齡，從中選出個體體重差異不顯著的黃羽肉雞90只，隨機分成3組，每組肉雞隨機分成5小組，每小組6只。生理鹽水對照組（30只），分別每只翅靜脈注射生理鹽水2 m L；LPS組（內毒素組）（30只），分別每只翅靜脈注射5 mg／kg LPS；AG＋LPS組（氨基胍治療組）（30只），分別每只翅靜脈注射300 mg／kg的AG，1 h后再分別翅靜脈注射5 mg／kg LPS。

1.2 樣品采集處理與線粒體的提取 各小組分別在處理后1、3、5、7、9 h的5個時間點采樣。用苯巴比妥鈉翅靜脈注射麻醉，剖腹取肝臟和十二指腸黏膜放入樣品袋中，標明樣品名稱和編號，立刻投入液氮中速凍，再置于－80℃的超低溫冰箱中保存?zhèn)溆茫?］。線粒體分離方法按藏瑩安方法提取，置于－80℃超低溫冰箱中儲存?zhèn)溆茫?］。

1.3 線粒體復合體Ⅰ的測定方法 分別取1 mol／m L Tris-HCl 50μL、1.3 mol／m L DCIP 50μL，、雙蒸水850μL左右，加入到紫外－可見分光光度計比色皿中（30℃，溫浴），再加入15 mmol／L的 NADH 50μL，用移液槍吹打多次，使其充分混勻，同時做一對照比色皿，立刻在600 nm的波長下進行時間掃描，掃描時間為300 s，當掃描45 s后，立刻打開分光光度計比色池的蓋子，在樣品比色皿中加入10～50μL的線粒體樣品，加完后，用移液槍快速吹打幾下，立刻蓋住蓋子繼續(xù)進行時間掃描，并得到酶動力學曲線［7］。

線粒體復合體Ⅰ活力的計算：復合體Ⅰ活力＝（△A／min sample－△A／min blank）÷21÷（取樣量×蛋白含量）

1.4 數據處理 應用SPSS統(tǒng)計分析軟件計算各組不同時間平均值和標準誤，通過Ducans新復極差檢驗法（DMRT法）比較各組間的差異。

2 結果與分析

2.1 腸黏膜線粒體復合體Ⅰ活性的測定結果 見圖1。

由圖1可知，分別用AG＋LPS及LPS處理后，LPS組肉雞腸黏膜線粒體復合體Ⅰ活性呈現(xiàn)先升高后降低再上升的動態(tài)變化曲線，5 h時線粒體復合體Ⅰ活性達到最高，7 h時后線粒體復合體Ⅰ活性下降，9 h時又升高；與生理鹽水組相比，各時間點線粒體復合體Ⅰ活性均顯著低于生理鹽水對照組（P＜0.05）。AG＋LPS組肉雞腸黏膜線粒體復合體Ⅰ活性呈現(xiàn)先升高后降低的動態(tài)變化曲線，3 h時線粒體復合體Ⅰ活性最高，隨后逐漸降低；與生理鹽水組相比，各時間點線粒體復合體Ⅰ活性均顯著低于生理鹽水組（P＜0.05）；與LPS組相比，在1、3 h時，線粒體復合體Ⅰ活性均顯著高于LPS組（P＜0.05），在5、7 h時，線粒體復合體Ⅰ活性與LPS組之間無顯著差異（P＞0.05），直到9 h時，線粒體復合體Ⅰ活性卻又顯著低于LPS組。

圖1 LPS和AG＋LPS對肉雞腸黏膜線粒體復合體Ⅰ活力的動態(tài)變化曲線

2.2 肝臟線粒體復合體Ⅰ活性的測定結果 見圖2。

由圖2可知，分別用LPS＋AG及LPS處理后，LPS組肉雞肝臟線粒體復合體Ⅰ活性呈現(xiàn)先升高后降低再上升的動態(tài)變化曲線，5 h時肝臟線粒體復合體Ⅰ活性達到最高，7 h時后下降，9 h時又升高；與生理鹽水組相比，各時間點肝臟線粒體復合體Ⅰ活性均顯著低于生理鹽水對照組（P＜0.05）。AG＋LPS組肉雞肝臟線粒體復合體Ⅰ活性呈現(xiàn)先升高后降低的動態(tài)變化曲線，3 h時肝臟線粒體復合體Ⅰ活性最高，隨后逐漸降低；與生理鹽水組相比，除3 h時肝臟線粒體復合體Ⅰ活性與生理鹽水組之間差異不顯著 （P＞0.05）外，其余各時間點均顯著低于生理鹽水組（P＜0.05）；與LPS組相比，在1、3 h時，肝臟線粒體復合體Ⅰ活性均顯著高于LPS組（P＜0.05），在5、7 h時，肝臟線粒體復合體Ⅰ活性與LPS組之間無顯著差異（P＞0.05），直到9 h時，肝臟線粒體復合體Ⅰ活性卻又顯著低于LPS組。

圖2 LPS和AG＋LPS對肉雞肝線粒體復合體Ⅰ活力的動態(tài)變化曲線

3 討論

AG對LPS毒害的線粒體復合體Ⅰ活性的作用線粒體是細胞內一個重要的細胞器，是產生能量的場所，其病變影響到細胞各成分的協(xié)調并危及細胞生命活動［3］。同時線粒體也是程序化死亡信號轉導途徑中起關鍵調節(jié)作用的細胞器［8－9］。線粒體復合體Ⅰ是線粒體電子傳遞鏈中5個復合體中較為重要的一個，其功能在于催化位于線粒體基質中由三羧酸循環(huán)產生的NADH＋H＋中2個H＋經FMN轉運到膜間空間，同時再經過Fe-S將2個電子傳遞到輔酶Q（UQ）。內毒素休克時，細胞能量生成障礙，其原因是線粒體內膜氧化磷酸化功能障礙。研究表明，內毒素作用下6h，幼鼠腸黏膜線粒體腸上皮細胞線粒體不同程度腫脹，嵴不清，空泡樣改變明顯，微絨毛排列不整、部分斷裂、部分緊密連接增寬等病理性損害，證明內毒素對腸黏膜的損傷［10］。大鼠在發(fā)生內毒素血癥時，肝線粒體質子跨膜能力下降，電子傳遞鏈中50%的復合物Ⅰ和Ⅲ的活性降低；肝線粒體偶聯(lián)程度下降，線粒體內膜電子傳遞障礙［11］。

本試驗研究表明，LPS顯著降低了各時間段肉雞腸黏膜線粒體和肝臟線粒體復合體Ⅰ的活性，這可能是由于LPS誘導機體產生了大量自由基，攻擊線粒體膜間的電子傳遞鏈，線粒體復合體Ⅰ受損傷，使其活性下降，導致線粒體內膜氧化磷酸化功能障礙，ATP生成減少；到了后期，隨著LPS在體內代謝的增加，含量減少，機體內抗氧化能力代償性回升，自由基生成減少，線粒體復合體Ⅰ的活力也代償性緩慢回升。注射AG＋LPS 1 h時，肉雞腸黏膜線粒體和肝臟線粒體復合體Ⅰ的活性未發(fā)生變化，3 h時卻顯著增加了肉雞腸黏膜線粒體和肝臟線粒體復合體Ⅰ的活性，這是由于AG對LPS具有明顯的頡頏作用，使LPS未能充分發(fā)揮誘導自由基的作用，從而使線粒體復合體Ⅰ受到損傷程度大大減少，其活性變化減少；5、7 h時，隨AG的消耗，肉雞腸黏膜線粒體和肝臟線粒體復合體Ⅰ的活性趨于正常；9 h時，AG消耗殆盡，肉雞腸黏膜線粒體和肝臟線粒體復合體Ⅰ的活性顯著降低。

4 結論

本試驗結果顯示，LPS在各時間段顯著降低了肉雞腸黏膜線粒體和肝臟線粒體復合體Ⅰ的活性（P＜0.05）。AG在3 h時卻顯著增加了肉雞腸黏膜線粒體和肝臟線粒體復合體Ⅰ的活性（P＜0.05），在9 h時，肉雞腸黏膜線粒體和肝臟線粒體復合體Ⅰ的活性顯著降低（P＜0.05）。結果表明，LPS誘導了線粒體的損傷，引起了能量代謝障礙，ATP生成減少；AG對LPS具有明顯的頡頏作用，對機體起到保護作用。

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