多重PCR技術對沙門菌毒力因子檢測

邱 立，郝華芳，王興龍，張淑霞，張耀相，張渭東，楊增岐

（西北農林科技大學動物醫學院，陜西 楊凌 712100）

沙門菌是腸桿菌科中一大類重要的人畜共患病病原菌，廣泛分布于自然界，是畜禽肉胴體、畜禽產品污染的重要來源，感染畜禽后可引起一系列的疾病，并可通過消化道等途經傳染給人，引起人的食源性疾病。

目前已發現，鼠傷寒、豬霍亂、都柏林沙門菌病、腸炎、羊流產、馬流產、雞傷寒、雞白痢、傷寒、丙型副傷寒等沙門菌具有毒性質粒，可增強對寄主腸黏膜上皮細胞的粘附與侵襲作用，提高在網狀內皮系統中存活和增殖的能力，其對小鼠的毒性比無毒性質粒菌株強數百至數萬倍不等［1－2］。然而到目前為止，用于鑒定沙門菌毒力的方法十分有限。小鼠致病性試驗是常用來評價細菌毒力的方法，但是受到小鼠品系、日齡、體重等多種因素影響，鑒定結果穩定性差，而且費時費力。特別是在獸醫臨床實踐中，快速確定病因能夠有效減少經濟損失，而沙門菌是臨床病料中最常分離到的細菌之一，快速確定沙門菌有無毒力，對準確確定病因具有重要意義。多重PCR方法，能夠快速簡便的鑒定有毒力的沙門菌，對標準菌株的檢測結果準確［3］，如果該方法同樣能夠準確鑒定臨床分離沙門菌毒力，將在給獸醫臨床診斷帶來極大方便。

為檢驗多重PCR檢測方法的臨床應用效果和研究陜西關中地區致病性沙門菌的流行情況，進行了以下試驗。

1 材料與方法

1.1 病料 在陜西楊凌、武功、寶雞等發病的畜禽場，無菌采取病死動物的肝臟、脾臟或發病部位；2～3周發病動物，用棉拭子采集新鮮糞便或采集尿液，無菌導尿或采集中段尿。A、D、E、G病料為豬病料，B病料為雞病料，C病料為羊病料，F病料為奶牛病料。

1.2 培養基 普通培養基、麥康凱培養基、伊紅－美藍培養基、S.S.瓊脂平板、蘇木素伊紅瓊脂培養基、亞硫酸鉍瓊脂培養基（BS）、普通肉湯等。硝酸鉀蛋白胨水，鄧亨氏蛋白胨水，葡萄糖蛋白胨水，明膠培養基，檸檬酸鹽利用培養基，三糖鐵培養基，O／F培養基及各種糖培養基等，均按常規方法［6－7］制備。

1.3 試劑 革蘭染色液、歐立希氏試劑、硝酸鉀還原試驗用甲液和乙液、M.R.試驗的甲基紅溶液、3%H2O2、10%FeCl3、V-P試驗用甲液和乙液等，均由西北農林科技大學動物科技學院獸醫微生物實驗室提供。DL-2 000、d NTP、Taq酶等試劑，購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.4 PCR引物 針對沙門菌組氨酸轉運操縱子hisJ、毒力質粒spvR基因、fliC基因的特異性引物由獸醫微生物學實驗室保存，序列見文獻［3］。

1.5 細菌的分離培養 將不同病料增菌，普通肉湯增菌，肉湯培養物變混濁，對增菌后的肉湯進行稀釋，針對不同形態的菌落，涂片、染色、鏡檢，采取劃線法進行挑純培養，直到獲得純培養物，置4℃的冰箱保存備用。

1.6 細菌的生化鑒定 用分離菌純培養物有目的進行糖發酵試驗，按文獻［5］方法進行。

1.7 細菌的致病性試驗 37℃培養分離鑒定的6株沙門菌，OD600達到1.0時用于攻毒試驗，接種方法按文獻［5］方法進行。分別腹腔注射5只昆明系小鼠（購自解放軍第四軍醫大學），每只小鼠注射108個菌落形成單位的細菌（CFU／m L），每隔6 h記錄小鼠死亡情況。

1.8 DNA提取和PCR檢測 參考劉華偉［6］等方法，進行沙門菌的DNA提取和多重PCR檢測，PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

2 結果

2.1 細菌分離結果 共分離菌株19株，分別用A1、A2、A3、B1、B2、C1、C2、C3、D1、D3、E1、E2、F1、F2、F3、G1、G2、G3、G4表示。

2.2 生化試驗鑒定結果 根據文獻［7］進行生化試驗鑒定，據生化試驗結果可知19株細菌中A1為豬霍亂沙門菌、A2為大腸桿菌、A3為豬葡萄球菌；B1為金黃色葡萄球菌、B2為雞沙門菌；C1為大腸桿菌、C2為費氏檸檬酸桿菌、C3為沙門菌I系；D1為溶血葡萄球菌、D2為不活躍大腸埃希氏菌；E1為沙門菌I系、E2為革蘭陽性球菌，未確定菌株；F1為大腸桿菌、F2為金黃色葡萄球菌、F3為鼠傷寒沙門菌；G1為革蘭陽性球菌，未確定菌株，G2為豬葡萄球菌、G3為腸鏈球菌、G4為豬傷寒沙門菌，生化試驗結果見表1。

表1 病料分離菌株生化試驗結果

2.3 PCR 鑒定結果 利用 SJF1／SJR1，SPF2／SPR2，SHF1／SHRi對分離菌株進行三重PCR檢測，PCR結果如圖1所示，A1、B2、C3、E1、F3、G4擴增出359 bp大小的hisJ條帶，為沙門菌菌株，A1、B2、F3擴增出大小為789 bp大小的spvR的條帶，為含毒力基因的菌株，而F3菌株還擴增出大小為523 bp的flic-i基因，表明F3菌株含有 H1-i抗原。

2.4 動物致病性試驗結果 每組用5只小鼠進行攻毒試驗，記錄攻毒小鼠死亡時間，并取死亡鼠脾臟進行細菌分離，結果見圖2和表2。小鼠最早死亡時間是攻毒后12 h，A1組5只小鼠最早全部死亡，最后1只小鼠死亡時間為攻毒后24 h，B2組和F3組最后一只小鼠死亡時間分別為攻毒后36 h和攻毒后30 h。G4組1只小鼠死亡，C3組和E1組小鼠未見死亡。對照組全部存活。

圖1 三重PCR檢測部分分離菌株

表2 沙門菌分離株感染小鼠的死亡率、分離率及剖檢變化

圖2 攻毒后小鼠存活只數

3 討論

PCR（Polymerase Chain Reaction）是一種特異基因的體外快速擴增技術，相比傳統的微生物檢測方法具有無需培養、快速簡便、特異性高、靈敏性強等優點，已廣泛用于病原微生物的快速檢測，尤其適用于不易分離培養及含量極少的病原微生物標本的快速檢測。多重PCR技術可同時檢測一種致病菌的多個基因，也可以同時檢測多種致病菌，相比普通PCR技術具有特異性增強、節約試劑、工作量低等優點，已廣泛應用于包括沙門菌在內的多種病原微生物的檢測與鑒定［8－11］。

傳統的沙門菌毒力檢測方法需要先進行細菌的分離培養，再結合生化分析和小鼠攻毒試驗綜合判斷，檢測過程復雜、周期長、所需試劑繁多。利用多重PCR技術可用于沙門菌毒力的快速檢測。

劉華偉等利用多重PCR技術特異性擴增沙門菌組氨酸轉運操縱子hisJ基因、毒力質粒spvR基因和H1抗原fliC基因。5株沙門菌強致病性標準菌株均能特異性擴增出沙門菌毒力質粒基因spvR［3］。但是該方法的推廣應用，需要臨床樣品的檢驗。因此，采集陜西省關中地區多家發病養殖場病料，利用多重PCR技術和生化分析與小鼠攻毒試驗分別對分離的可能的致病菌進行鑒定，多重PCR技術結果與生化分析結果一致，毒力基因攜帶情況與小鼠攻毒結果基本一致，PCR對所有非沙門菌均表現為陰性；體現了該方法對臨床分離菌株應用的準確性。多重PCR不僅快速檢測出分離沙門菌，而且可以確定其毒力強弱，為沙門菌的流行病學調查和沙門菌食品污染檢疫帶來很大方便。

同時本次試驗中探明在陜西關中地區流行的沙門菌具有多種類型，致病性強弱不同，并且致病性沙門菌菌株占總分離沙門菌菌株比例較高，說明沙門菌是陜西關中地區畜禽養殖的重要威脅，需要加強關注。

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