牛奶及奶粉中三聚氰胺殘留酶聯免疫檢測方法的研究

張建勛，王戰輝，王亞輝，吳小平，李建成，王照鵬，江海洋，沈建忠

（1.中國農業大學動物醫學院，北京 海淀 100193；2.遼寧省畜牧獸醫局，遼寧 沈陽 110001；3.北京維德維康生物技術有限公司，北京 海淀 100085）

三聚氰胺（Melamine，MEL）是典型的三嗪類化合物，分子式為C3H6N6，主要用于生產三聚氰胺甲醛樹脂。目前食品和飼料工業蛋白質含量測試大多采用測定總氮的方法，因三聚氰胺含氮量高達66%左右［1］，故而常被非法添加至食品和飼料中以提高蛋白質含量指標，給消費者健康帶來危害。

目前，關于檢測食品及飼料中三聚氰胺的殘留的方法，國內外已有很多報道，其中包括高效液相色譜 法 （HPLC）［2］、高 效 液 相 色 譜－串 聯 質 譜 法（HPLC-MS／MS）［3－4］、氣相色譜－質譜法（GC-MS）［5］等。這些方法雖能準確檢測，但都需要大型儀器，樣品前處理步驟復雜、耗時，因此，建立靈敏、準確、快速的檢測方法是非常必要的。

本試驗通過制備三聚氰胺抗原、抗體，建立牛奶及奶粉中三聚氰胺快速檢測的酶聯免疫檢測方法，為進一步研制牛奶及奶粉中三聚氰胺快速檢測試劑盒奠定基礎。

1 材料

1.1 主要試劑 三聚氰胺（Melamine，99.0%），牛血清白蛋白（BSA），卵清蛋白（OVA），N，N-二環己基碳二亞胺（DCC），N-羥基琥珀酰亞胺（NHS），弗氏完全佐劑，弗氏不完全佐劑，聚乙二醇（PEG），均購 自 Sigma 公 司；4，6-二 氨 基-2-氯-1，3，5-三 嗪（CAAT，98.0%），購自北京易萊西諾生物科技有限公司；對氨基苯丁酸及其他試劑均為分析純，購自北京化學試劑有限公司；DMEM培養基，HAT，HT培養基，購自Gibco公司。

1.2 主要溶液（0.02 mol／L，p H 值7.2 PBS；包被液（0.05 mol／L，p H 值9.6 碳酸鹽緩沖液） 洗滌液（含0.05%吐溫20的 PBS）；封閉液（2%包被液）；樣品稀釋液（Na2HPO4·12H2O 12.48 g，Na H2PO4·2H2O 7.04 g，加水至400 m L）.

1.3 試驗動物和融合細胞 BALB／c小鼠，購自北京實驗動物研究中心；SP2／0細胞，由農業部獸醫診斷中心惠贈。

2 方法

2.1 三聚氰胺免疫原和包被原的合成 稱取CAAT 0.430 g懸浮于10 m L無水乙醇中，加入0.5 g對氨基苯丁酸，加入KOH，使其終濃度為85%；反應混合物75℃水浴回流24 h，分別在16 h和19 h的時候，加入0.37 g對氨基苯丁酸和180 mg KOH；產物過濾，減壓蒸餾，獲得油狀物質。產物溶解于30 m L 5%碳酸鈉溶液，10 m L二氯甲烷洗滌兩次，水相用濃鹽酸調p H值至1，收集沉淀，干燥獲得三聚氰胺半抗原，命名為p-ABTAAT。

p-ABTAAT溶解于N，N-二甲基甲酰胺，分別加入等摩爾數的DCC和NHS，室溫反應12 h，離心，除去沉淀，得到溶液Ⅰ；向溶液Ⅰ中加入溶有100 mg BSA或67 mg OVA的水溶液5 m L，室溫反應12 h；反應液用蒸餾水透析5 d，離心分離出上清液，即得到三聚氰胺免疫原或包被原p-ABTAAT-BSA（或p-ABTAAT-OVA）。

2.2 動物免疫 取100μg p-ABTAAT-BSA偶聯物，加等量弗氏佐劑，制成乳化劑，免疫8周齡雌性BALB／c小鼠5只，免疫6次，每次間隔2周。除最后1次免疫為腹腔注射外，其余均為頸背部皮下多點注射。3免后7～10 d，小鼠眼眶采血，采用間接ELISA方法測定血清效價。

2.3 三聚氰胺單克隆抗體的制備

2.3.1 細胞融合 選取血清效價高和抑制效果好的小鼠用作融合。取小鼠脾細胞與SP2／0細胞在PEG2000作用下融合。將融合后細胞懸液加入到鋪有飼養細胞的96孔板中，以HAT和HT培養基選擇培養。

2.3.2 雜交瘤細胞篩選及克隆化 融合后7～10 d采用間接ELISA方法篩選效價高的陽性細胞，再采用間接競爭ELISA方法檢測陽性細胞分泌的抗體是否對三聚氰胺具有特異性。選擇OD值較高且克隆數目較少的陽性細胞進行4次亞克隆。

2.3.3 單克隆抗體的生產 取雌性BALB／c小鼠，注射滅菌石蠟油0.5 m L／只，7～15 d腹腔注射陽性克隆雜交瘤細胞0.5×106／m L～1×106／m L／只。10 d后，抽取小鼠腹水。經辛酸－飽和硫酸銨法提純，分裝凍干保存。

2.4 間接競爭ELISA標準曲線的建立 用包被緩沖液將包被抗原p-ABTAAT-OVA稀釋為一定濃度，100μL／孔，4℃過夜；傾去孔內液體，用洗滌液洗滌4次，拍干。每孔加入150μL封閉液，37℃恒溫封閉1 h，洗滌4次，拍干；將50μL抗體與等體積倍比稀釋的三聚氰胺標準液加到酶標板上反應，每孔100μL，37℃反應1 h，洗滌4次，拍干；每孔加入100μL HRP-羊抗鼠IgG，37℃反應1 h，洗滌4次，拍干；每孔加入TMB溶液100μL，37℃顯色15 min，然后每孔加入50μL 2 mol／L H2SO4以終止反應，最后用酶標儀測定各孔的OD450nm值。

2.5 交叉反應率的測定 采用間接競爭ELISA，將其他藥物系列稀釋，用交叉反應待測藥物代替三聚氰胺。用下式計算各競爭物與三聚氰胺抗體的交叉反應率。

交叉反應率＝［IC50（melamine）／IC50（競爭物）］×100%

2.6 樣品處理

2.6.1 牛奶 取100μL加入900μL樣品稀釋液，充分混勻，取50μL用于檢測。

2.6.2 奶粉 稱取1.00±0.01 g于50 m L離心管中；加入6 m L蒸餾水充分混勻；取100μL加入900 μL樣品稀釋液，充分混勻；取50μL用于檢測。

2.7 添加回收率的測定 以500μg／L、1 000μg／L和2 000μg／L 3個濃度添加牛奶；以1.0 mg／kg、2.0 mg／kg和3.0 mg／kg 3個濃度添加奶粉。按照2.6所述方法進行提取。

3 結果與分析

3.1 三聚氰胺半抗原的鑒定 經質譜鑒定半抗原結構，發現其分子離子峰為289（M＋1）。半抗原化合物的元素分析結果（%）：C，54.16；H，5.59；N，29.15；O，11.10。由上可知，化合物的分子量為288，分子中含有2個O，13個C。說明三聚氰胺半抗原合成成功。

3.2 雜交瘤細胞株的建立 細胞融合后第7天，取上清液用間接ELISA方法檢測。選擇陽性中OD值高的，克隆數目較少的孔，經過4次亞克隆，得到1株能穩定分泌三聚氰胺單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為5F9。體內誘生腹水法獲得單克隆抗體，腹水效價可達1.5×105。

3.3 三聚氰胺標準曲線的建立 確定包被抗原的最佳稀釋濃度為1∶2 000，單克隆抗體的工作濃度為1∶80 000。采用間接競爭ELISA法建立檢測三聚氰胺的競爭抑制曲線，此抑制曲線針對三聚氰胺的IC50為61.3 ng／m L。見圖1。

圖1 三聚氰胺間接競爭ELISA標準曲線

3.4 交叉反應率的測定 該株單抗與三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺、4，6-二氨基-2-氯-1，3，5-三嗪的交叉反應率分別為100.0%、1.3%、1.67%、2.45%、2.75%。見表1。

3.5 添加回收率的測定 以500μg／L、1 000μg／L和2 000μg／L 3個濃度添加牛奶，回收率在76.4%～91.0%，變異系數在2.4%～14.5%；以1.0 mg／kg、2.0 mg／kg和3.0 mg／kg 3個濃度添加奶粉，回收率在68.1%～83.8%，變異系數在3.4%～9.0%。結果見表2。

表1 三聚氰胺單克隆抗體的交叉反應率

表2 牛奶及奶粉中三聚氰胺的添加回收結果

4 討論

4.1 三聚氰胺人工抗原的制備 免疫半抗原設計的原則是免疫半抗原與載體連接后能最大程度的保持和突出待測物的特征結構［6］。三聚氰胺分子上有3個氨基，它們的反應活性是一樣的，若采用戊二醛法或通過鹵代羧酸將氨基取代，則很有可能形成一元、二元甚至三元取代的混合物。這樣的話，就破壞了三聚氰胺游離氨基的特征結構。因此，選擇4，6-二氨基-2-氯-1，3，5-三嗪作為先導化合物，CAAT 上的 Cl原子很容易被對氨基苯丁酸的氨基H原子取代，形成能最大程度保留三聚氰胺特征結構的半抗原。

4.2 三聚氰胺單克隆抗體 根據表1中交叉反應率的測定結果，說明該抗體的特異性較高。同時表明三嗪環上的3個氨基在與抗體識別過程中發揮著重要作用。另外，就4，6-二氨基-2-氯-1，3，5-三嗪的低交叉反應率，可能與其結構上的氯原子的強吸電子效應有關。

4.3 牛奶、奶粉樣品的測定 免疫分析方法的樣品前處理較為簡單，但基質效應對免疫測定有一定影響。Yin［7］等建立間接競爭ELISA方法檢測牛奶、奶粉及飼料中三聚氰胺殘留時，將牛奶樣品10倍稀釋后直接測定，奶粉樣品經0.02 M醋酸緩沖液沉淀蛋白，上清液10倍稀釋后測定。本試驗中，對牛奶、奶粉都是直接10倍稀釋后上樣檢測。從對基質效應的分析來看，1∶10倍稀釋的樣品已基本上消除了生物基質對檢測的影響。

該方法快速、靈敏、簡便、可靠，完全符合目前對牛奶及奶粉中三聚氰胺快速檢測的需求。

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