山茱萸總苷干預(yù)急性缺氧乳鼠心肌細(xì)胞凋亡的研究1）

陳克芳，李建軍，潘愛珍，黃啟輝，侯祥平

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 出生1 d～3 d的SD大鼠，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基，吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司產(chǎn)品；DMEM無糖培養(yǎng)基，Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清，Gbico公司產(chǎn)品；0.25%胰蛋白酶，吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司產(chǎn)品；青霉素－鏈霉素溶液，Gibco公司產(chǎn)品；抗α－Sarcomeric actin，武漢博士德生物有限公司產(chǎn)品；TUNEL－QIA39細(xì)胞凋亡試劑盒，購自Merck公司；SABC試劑盒及DAB顯示試劑盒，購自武漢博士德生物有限公司。

1.3 藥物 山茱萸，廣東一方制藥有限公司提供。

1.4 主要儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，Thermo公司；熒光顯微鏡，Nikon公司。

1.5 方法

1.5.1 山茱萸總苷提取物制備 由廣東省中醫(yī)研究所按文獻(xiàn)［1］方法提取，提取物濃縮干燥至粉末狀。

1.5.2 心肌細(xì)胞原代培養(yǎng) 將出生1 d～3 d的SD大鼠，用75%酒精消毒后取出心臟，迅速放入4℃預(yù)冷D－Hank’s液的培養(yǎng)皿中，洗去心臟表面及血管中的血細(xì)胞，剪去心房和大血管。將心臟剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，加入約10 m L0.125%胰酶消化液，于37℃水浴箱中分次消化，每次約10 min。收集除第1次以外的細(xì)胞懸液于50 m L離心管中，加入含量為10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，終止消化。1000 r/min離心5 min，棄上清，加入含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，輕輕吹打使其形成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液吸入培養(yǎng)皿中，按差速貼壁法于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1.5 h，去除成纖維細(xì)胞，純化心肌細(xì)胞。之后輕輕收集尚未貼壁的細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/m L～5×105/m L，接種于6孔培養(yǎng)板中。細(xì)胞于37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)，每2天換一次液，培養(yǎng)3 d～4 d后使用［2］。

1.5.3 實(shí)驗(yàn)分組 缺氧模型組：正常培養(yǎng)3 d的心肌細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，換成無糖DMEM液，用無菌液狀石蠟封住液體表面，使細(xì)胞缺氧［3］。對(duì)照組：心肌細(xì)胞不做任何處理，正常條件培養(yǎng)。山茱萸總苷干預(yù)組：細(xì)胞缺氧處理之前24 h在培養(yǎng)液中加入0.49 g/L的山茱萸總苷，缺氧培養(yǎng)的同時(shí)亦加入0.49 g/L的山茱萸總苷進(jìn)行干預(yù)。各組設(shè)1 h、2 h、3 h、5 h 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行指標(biāo)觀察。

1.5.4 心肌細(xì)胞的鑒定 按照SABC抗α－橫紋肌肌動(dòng)蛋白試劑盒說明方法：將培養(yǎng)3 d的細(xì)胞爬片，用4%多聚甲醛固定30 min。然后用30%H2O21份＋純甲醇50份混合液室溫浸泡30 min后蒸餾水洗1次～2次，滴加5%BSA封閉液，室溫20 min，甩去多余液體，滴加1∶100稀釋的一抗（小鼠抗大鼠α－Sarcomeric actin），對(duì)照組用蒸餾水代替一抗，37℃孵育1 h，PBS洗2 min×3次。滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，室溫20 min，PBS洗2 min×3次。滴加試劑SABC，37℃20 min，PBS洗5 min×4次。二甲苯透明，中性樹膠封片［4］。

1.5.5 TUNEL檢測心肌細(xì)胞的凋亡率 將培養(yǎng)的細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定，室溫孵育10 min后，將玻片浸沒在1×TBS溶液中，室溫孵育15 min。每個(gè)樣本玻片上滴加50μL～100 μL濃度為20μg/mL的蛋白酶K溶液，室溫孵育5 min。用1×TBS溶清洗樣本2次～3次。滴加100μL×Td T平衡緩沖液，室溫孵育20 min后，在每個(gè)樣本上立即滴加60μL Td T標(biāo)記反應(yīng)混合物，置于濕盒中于37℃孵育90 min。將樣本玻片置于1×TBS溶液中室溫孵育1 min。去掉多余液體，換用新鮮1×TBS溶液室溫孵育1 min，重復(fù)1次。用濾紙輕輕擦掉樣本周圍及背面的TBS溶液，逐滴滴加Mounting Media封片劑并蓋上 蓋玻片。使用熒光顯微鏡分別用330 nm～380 nm及465 nm～495 nm波長下激發(fā)熒光，計(jì)數(shù)所有細(xì)胞和凋亡細(xì)胞，計(jì)算出凋亡率［5］。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，圖片制作采用SPSS13.0及EXCEL進(jìn)行，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組計(jì)量數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)之間的比較采用單因素方差分析（One－way ANOVA），檢驗(yàn)水平取α＝0.05。

2 結(jié) 果

2.1 心肌細(xì)胞培養(yǎng) 在倒置相差顯微鏡下觀察，培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞已基本貼壁，并伸出偽足，形態(tài)呈梭形、菱形或不規(guī)則多邊形。培養(yǎng)72 h后，心肌細(xì)胞融合成片，形成單細(xì)胞層，細(xì)胞搏動(dòng)呈現(xiàn)同步化，每分鐘120次左右。

2.2 心肌細(xì)胞鑒定 心肌細(xì)胞中含有α－Sarcomeric actin，本實(shí)驗(yàn)選用的一抗為小鼠抗大鼠α－橫紋肌肌動(dòng)蛋白，因此染色后心肌細(xì)胞胞漿將被著深棕色，而非心肌細(xì)胞則呈陰性染色。心肌細(xì)胞的純度鑒定采用每張玻片隨機(jī)取10個(gè)視野，分別計(jì)算出心肌細(xì)胞陽性率，重復(fù)3次并取平均值為97.26%、96.875%、96.97%，三者取平均值為97.035%，因此本實(shí)驗(yàn)心肌細(xì)胞的純度為97.035%。

2.3 TUNEL檢測心肌細(xì)胞的凋亡率（見表1） 正常對(duì)照組心肌細(xì)胞凋亡率極低。而在心肌細(xì)胞缺氧2 h后凋亡率明顯增高 ，3 h～5 h后達(dá)到高峰，與對(duì)照組相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。用山茱萸總苷干預(yù)治療后，治療組與缺氧組相比凋亡率明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表1 各組心肌細(xì)胞的凋亡率比較（ ±s） %

表1 各組心肌細(xì)胞的凋亡率比較（ ±s） %

組別 凋亡率對(duì)照組 0.55±0.05缺氧組 1 h 16.22±1.001）2 h 60.81±3.311）3 h 96.12±1.331）5 h 98.77±0.431）治療組 1 h 4.06±0.252）2 h 10.14±0.622）3 h 15.27±1.182）5 h 27.53±1.282）與對(duì)照組比較，1）P＜0.01；與缺氧組相比，2）P＜0.01

2.4 山茱萸總苷干預(yù)急性缺血乳鼠心肌細(xì)胞TUNEL染色結(jié)果 對(duì)照組正常心肌細(xì)胞陽性著色的細(xì)胞核很少；隨著缺氧時(shí)間延長，陽性著色比例較對(duì)照組組明顯增多；治療組較缺氧組陽性著色比例明顯減少。

3 討 論

長期以來，細(xì)胞壞死一直被認(rèn)為是缺血性心肌死亡的唯一方式［6］。但是最近研究結(jié)果顯示，急性心肌梗死時(shí)早期心肌細(xì)胞死亡的主要方式為細(xì)胞凋亡，而不是心肌細(xì)胞的壞死，并且心肌梗死晚期也存在心肌細(xì)胞的凋亡［7，8］。心肌細(xì)胞凋亡與壞死是完全不同的，有研究［9］證實(shí)細(xì)胞凋亡于心肌缺血2 h后發(fā)生，4 h～5 h時(shí)最明顯，6 h后開始減少，這點(diǎn)在本研究中也得到了驗(yàn)證。結(jié)果顯示，原代培養(yǎng)的SD乳鼠心肌細(xì)胞在正常情況下幾乎沒有心肌細(xì)胞的凋亡，但在缺氧時(shí)可以引起心肌細(xì)胞的凋亡，并且隨著缺氧時(shí)間的延長，凋亡細(xì)胞不斷增加，缺氧5 h時(shí)達(dá)到最高，凋亡率幾乎達(dá)到98%。因此，防治心肌細(xì)胞凋亡是治療急性心肌梗死新的治療靶點(diǎn)。

現(xiàn)代藥理研究表明，山茱萸總苷有抗炎和殺菌作用［10］，抗氧化損傷作用［11］，對(duì)急性缺血缺氧的心肌具有保護(hù)作用［12］。急性心肌缺血時(shí)線粒體的能量耗竭及活性氧的釋放是導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡和壞死的主要病理改變，已有研究證實(shí)，中藥山茱萸對(duì)于實(shí)驗(yàn)性心肌梗死大鼠模型的心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，給予山茱萸總苷干預(yù)后，缺氧乳鼠心肌細(xì)胞凋亡率明顯下降，而且各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的凋亡率均降低。可見山茱萸總苷可以抑制心肌細(xì)胞的凋亡，保護(hù)缺氧心肌細(xì)胞。但山茱萸總苷通過什么作用途徑抑制心肌細(xì)胞凋亡，尚需深入研究。

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