古嶺龍保健酒的遺傳毒性研究

吳超偉 韋杏泉 覃 良 李春籬

1.廣西中醫藥研究院，廣西 南寧 530022;2.廣西柳州市古嶺酒廠，廣西 柳州 545107; 3.廣西產品質量監督檢驗院，廣西 南寧 530022

目前人們由于生活節奏快，長期缺少體育鍛煉，易疲勞和免疫力低下的亞健康人群有很多。針對以上人群，我們從扶正固本，調節臟腑功能入手，綜合調整機體臟腑功能，使精、氣、血液生有源，行有力的傳統中醫藥養生保健理論，自主研制了古嶺龍保健酒。是根據傳統中藥組方，結合現代新工藝研究制作的一種藥酒，酒體黃色澄明透亮，香味濃郁，醇厚柔和，回味綿長。本品主要成分是絞股藍、西洋參、黨參、大棗、枸杞子、淫羊藿、黃精、龍眼肉、羅漢果等中藥，具有調補肝腎，滋脾養肺，補氣養血，扶正祛邪等免疫增強和緩解體力疲勞的保健作用。長期使用的實踐結果表明，古嶺龍酒具有增強免疫功能和抗疲勞等藥理作用，且無任何毒副作用的特點。為了評價其飲用的安全性，本品是按照國家保健食品的法規要求，考察其遺傳毒性。本實驗采用Ames試驗、小鼠骨髓細胞微核試驗和小鼠精子畸形試驗評價不同濃度的古嶺龍酒的抗突變作用。現將實驗結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑 古嶺龍保健酒 (規格:125mL/瓶、批號:2009121001)，實驗前按要求把古嶺龍保健酒用水浴濃縮成濃縮液 (比重為1.3，不含乙醇);91%乙醇的酒基(含40%乙醇的酒基經二次蒸餾得到)(均由廣西柳州市古嶺酒廠提供);環磷酰胺(山西普德藥業有限公司，批號: 1106114);敵克松、疊氮鈉、2－氨基芴均購自Sigma公司。

1.1.2 實驗動物 SPF級昆明種小鼠，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號:SCXK(桂) 2009－0002。實驗動物質量合格證號:0001412。實驗動物室溫度:22～25℃，相對濕度:55～75%。喂顆粒飼料，自由飲水。

1.1.3 實驗菌株 鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型系列菌株TA97a、TA98、TA100、TA102由廣西區疾病預防控制中心提供。菌株經組氨酸依賴性試驗、結晶紫抑菌試驗、紫外線敏感試驗、R因子的鑒定和PAQ1質粒的鑒定，自發回變數和鑒別性致突變物反應均合格。

1.2 方法

1.2.1 Ames試驗［1］采用平板摻入法。用經鑒定符合要求的鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型TA97a、TA98、TA100、TA102四種菌株進行試驗。以多氯聯苯誘導的大鼠肝微粒體酶 (S－9)作為體外代謝活化系統。采用平板摻入法，在保溫的頂層培養基中依次加入0.1mL試驗菌株增菌液、0.1mL受試物溶液和0.5mL S－9混合液 (當需要代謝活化時)，混勻后倒入底層培養基平板上。5個試驗劑量分別為5000、1000、200、40、8μg/皿，同時設自發回變對照、溶劑對照和陽性突變劑對照。自發回變對照除不加樣品外，其余條件與樣品組相同。溶劑對照用純水替代樣品，其余條件與樣品組相同。在無菌操作條件下，用滅菌純水將濃縮液樣品分別配成50、10、2、0.4、0.08mg/mL 5個濃度，經0.22μm孔徑濾膜過濾除菌后作為受試溶液。每個劑量組的各種菌株均做3個平行皿。在37℃下培養48小時，計數每皿的菌落數。整套試驗在相同條件下重復做兩次。如果受試物的回變菌落數增加超過自發回變菌落數的2倍以上，并具有劑量－反應關系者，即為誘變試驗陽性。

1.2.2 小鼠骨髓細胞微核試驗［2］選體重為25～30g的昆明種小鼠60只，隨機分成6組，每組10只，雌雄各半。試驗組3個劑量分別設21710、10855、5427.5mg/kg BW，設陰性對照 (純水)、酒基對照 (15%乙醇)和陽性對照。稱取108.55g古嶺龍保健酒濃縮液樣品，加含91%乙醇的酒基至100mL，混勻，配成1085.5mg/mL濃度溶液，試驗液的乙醇終濃度為15%;再用含15%乙醇的酒基溶液將1085.5mg/mL濃度溶液依次對倍稀釋成542.75、271.38mg/mL濃度，試驗液的乙醇終濃度均為15%。按0.4mL/20g BW的體積給相應劑量組動物灌胃1085.5、542.75、271.38mg/mL濃度，陰性對照組灌給純水，酒基對照組灌給15%酒基溶液，陽性對照組灌給2mg/mL的環磷酰胺 (cp)溶液 (劑量為40mg/kg BW)。第二次給受試物后6小時頸椎脫臼處死動物，取胸骨骨髓用小牛血清稀釋涂片，甲醇固定，Giemsa染色。在光學顯微鏡下，每只動物計數1000個嗜多染紅細胞 (PCE)，微核率以含微核的PCE千分計率，同時計數200個嗜多染紅細胞，計算嗜多染紅細胞與成熟紅細胞的比值 (PCE/ NCE)。采用泊松分布均數比較法統計處理。如試驗組的微核率比陰性對照組增高，并有明顯的劑量－反應關系和統計學意義，即為陽性結果。

1.2.3 小鼠精子畸形試驗［3］選體重為25～35g的昆明種雄性小鼠60只，隨機分成6組，每組10只。試驗組3個劑量分別設21710、10855、5427.5mg/kg BW，設陰性對照(純水)、酒基對照(15%乙醇)和陽性對照(環磷酰胺)。稱取108.55g古嶺龍保健酒濃縮液樣品，加含91%乙醇的酒基至100mL，混勻，配成1085.5mg/mL濃度溶液，試驗液的乙醇終濃度為15%;再用含15%乙醇的酒基溶液將1085.5mg/mL濃度溶液依次對倍稀釋成542.75、271.38mg/ mL濃度，試驗液的乙醇終濃度均為15%。按0.4mL/20g BW 的體積給相應劑量組動物灌胃 1085.5、542.75、 271.38mg/mL濃度，陰性對照組灌給純水，酒基對照組灌給15%酒基溶液，陽性對照組灌給2mg/mL的環磷酰胺(cp)溶液 (劑量為40mg/kg BW)。每天灌胃一次，連續5天。末次給樣后第30天處死動物，取副睪的精子涂片，甲醇固定，伊紅染色。在光學顯微鏡下，每只動物計數完整精子1000個，計算精子畸形率。

1.2.4 實驗數據統計 應用SPSS統計軟件進行單因素方差分析。在統計分析分析時，先對數據進行方差齊性檢驗，若方差齊，采用單因素方差分析進行總體比較，發現差異再用Dunnett檢驗進行多個劑量組與對照組均數間的兩兩比較。若方差不齊則對數據進行適當的變量轉換，滿足方差性檢驗后，用轉換后的數據進行統計;若轉換數據仍未達到方差齊要求，改用秩和檢驗進行統計，發現總體比較有差異。

2 結果

2.1 對Ames試驗的影響 表1、表2結果表明，古嶺龍保健酒各劑量組的回變菌落數均未超過自發回變菌落數的兩倍，亦無劑量－反應關系，這表明古嶺龍酒在試驗劑量范圍內，S－9對鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型系列菌株TA97a、TA98、TA100、TA102四種試驗菌株均無致突變性。

表1 古嶺龍保健酒Ames試驗結果

2.2 陽性對照 TA97a+S9、TA98+S9、TA100+S9采用2－氨基芴 (劑量為10μg/皿);TA98－S9采用柔毛霉素(劑量為6μg/皿);TA97a－S9、TA102－S9采用敵克松(劑量為50μg/皿);TA100－S9采用疊氮鈉 (劑量為1.5μg/皿);TA102+S9采用1，8－二羥基蒽醌 (劑量為50μg/皿)。表2同。

表2 古嶺龍保健酒Ames試驗結果 (第二次)

2.3 對小鼠骨髓細胞微核試驗的影響 表3結果表明，古嶺龍保健酒各劑量組小鼠的骨髓細胞微核率與酒基對照和陰性對照組比較，差異均無顯著性 (P＞0.05)，而環磷酰胺陽性對照組與陰性對照組比較差異有極顯著性(P＜0.01)。古嶺龍酒對小鼠的骨髓細胞染色體未見損傷。

2.4 對小鼠精子畸形試驗的影響 表4結果表明，古嶺龍保健酒各劑量組對小鼠精子畸形發生率未產生明顯改變，樣品各劑量組的精子畸形率與酒基對照和陰性對照組比較，差異均無顯著性 (P＞0.05)，而環磷酰胺陽性對照組與陰性對照組比較差異有極顯著性 (P＜0.01)，說明該樣品無致小鼠精子產生畸變作用。

3 討論

本項研究執行《食品安全性毒理學評價程序和方法》和 (GB15193－94)。Ames試驗從基因水平上反映了遺傳物質受損傷情況，微核的產生與染色體斷裂及紡錘體受損有關，微核率的大小可間接反映染色體受損情況。本研究結果顯示，在無論有無活化系統 (S－9混合液)存在情況下，古嶺龍酒對TA97a、TA98、TA100、TA102四種菌株各劑量組的回變菌落數均接近自發突變，與陰性對照組比較無顯著性差異，亦無劑量－反應關系。結果提示古嶺龍酒在體外Ames試驗未發現致突變作用。在試驗劑量范圍內，未發現對小鼠的骨髓細胞有致突變作用，也未發現對試驗小鼠精子產生畸變作用。

表3 古嶺龍保健酒對小鼠的骨髓細胞微核發生率的影響

表4 古嶺龍保健酒對小鼠精子畸形發生率的影響

在本試驗條件下，上述結果表明古嶺龍保健酒沒有遺傳毒性和潛在致癌性。因此，古嶺龍酒在遺傳毒性方面是安全的。

［1］衛生部《保健食品檢驗與評價技術規范》(2003年版)《鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶實驗》，2003:189.

［2］衛生部《保健食品檢驗與評價技術規范》(2003年版)《骨髓細胞微核試驗》，2003:198.

［3］衛生部《保健食品檢驗與評價技術規范》(2003年版)《小鼠精子畸形試驗》，2003:203.