HPLC法測定消腫止痛巴布膏中梔子苷的含量

韋金燕 陸瑞勇

廣西壯族自治區花紅藥業股份有限公司，廣西 柳州 541004

消腫止痛巴布膏是在消腫止痛酊的基礎上，采用巴布膏制劑成型技術制備改變劑型而成。處方采用木香、防風、黃藤、荊芥、細辛、五加皮等二十一味飲片組成，具有祛寒化濕，驅風通絡，活血化瘀，消腫止痛的功效，用于風寒濕痹、關節疼痛、跌打損傷、瘀血腫痛等癥。梔子為方中君藥之一，其所含梔子苷為其主要活性成分，有關梔子苷的含量測定，已有很多報道，多為HPLC法測定，而且中國藥典2010年版收載的梔子含量測定即為高效液相法［1］。消腫止痛酊未制訂君藥梔子的含量測定項，本文采用高效液相色譜法測定消腫止痛巴布膏中梔子苷含量，方法專屬性強，穩定性、重復性好、簡單、準確，結果可靠，可用于消腫止痛巴布膏的質量控制。

1 儀器與試藥

日本島津SPD－10AT高效液相色譜儀;SPD－10Avp檢測器;

梔子苷 (中國藥品生物制品檢定所;批號:110749－200410，供含量測定用);消腫止痛巴布膏 (廣西壯族自治區花紅藥業股份有限公司提供)，甲醇為色譜純，水為去離子水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Kromasil C18柱 (250mm×4.6mm，5μm);流動相為:甲醇－水 (27∶73);檢測波長240nm;流速1.0m l ·min－1;柱溫:30℃，理論板數以梔子苷峰計算應不低于3000。

2.2 供試品溶液的制備

取重量差異項下的供試品，剪碎，取約1.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50ml，密塞，稱定重量，加熱回流30分鐘，放冷，稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3 對照品溶液的制備

精密稱取梔子苷對照品適量，用50%甲醇制成每1ml含30μg的溶液，即得。

2.4 陰性對照溶液的制備

取缺梔子陰性樣品，照“2.2”項下供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。

2.5 線性關系考察

精密稱取梔子苷對照品適量，用50%甲醇制成每1ml含0.3276mg的對照品貯備液，分別精密量取對照品貯備液0.20，0.50，1.00，2.00，3.00，4.00ml，置10ml量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得，分別進樣10μl，注入液相色譜儀，分別測定峰面積，以梔子苷對照品的進樣量為橫縱標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，結果梔子苷的回歸方程為Y=1621.9X－12.89，r=0.9999(n=6)。結果表明梔子苷在0.06552～1.3104μg范圍內，線性關系良好。

2.6 專屬性試驗

精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各10μl，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定。結果陰性對照溶液在與梔子苷對照品相同保留時間處未顯色譜峰，故認為無干擾，見圖1。

2.7 精密度試驗

精密吸取供試品溶液10μl，注入液相色譜儀，測定峰面積，連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果梔子苷峰面積的RSD=0.77%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.8 穩定性試驗

精密吸取同一供試品溶液和對照品溶液10μl，在24小時內分別進樣6次 (0、1、2、4、8、12h)，記錄峰面積，結果供試品溶液梔子苷峰面積的RSD=1.49%(n=6)，對照品溶液梔子苷峰面積的RSD=0.57%(n=6)，表明供試品溶液及對照品溶液在12h內基本穩定。

2.9 重復性試驗

取批號20050901樣品6份，除去蓋襯，按上述方法提取和測定，結果梔子苷平均含量為0.890mg/g，RSD= 1.61%(n=6)，表明該方法重復性良好。

2.10 加樣回收率試驗

取已知含量樣品 (批號 20050901，梔子苷含量0.890mg/g)，取本品，除去蓋襯，剪碎，取約0.9g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，準確加入梔子苷對照品貯備液(0.3536mg/ml)2.0m l，精密加入70%甲醇50m l，按上述制備方法及色譜條件測定，分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，計算回收率，結果分別見表1。

表1 梔子苷加樣回收率試驗結果

2.11 樣品測定

制備5批樣品的供試品溶液，精密吸取對照品與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定峰面積，外標法計算樣品中梔子苷的含量。結果見表2。

表2 樣品含量測定結果(n=5)

5批生產樣品所用三批梔子藥材中梔子苷含量平均值為5.3%，5批樣品的梔子苷提取轉移率約為73%，根據上述測定結果，以及根據中國藥典2010年版一部對梔子藥材梔子苷含量限度規定，將5批消腫止痛巴布膏中梔子苷平均含量下調20%，梔子苷提取率以58%計算，故暫定本品每片含梔子以梔子苷計，不得少于1.7mg。

3 討論

3.1 提取條件的選擇

本實驗供試品溶液制備對提取溶劑 (50%乙醇、70%甲醇;70%乙醇)、提取時間 (加熱回流20、30、40分鐘)進行對比考察，測定的結果表明，幾種溶劑的測定結果有差異性，用70%乙醇作提取溶劑含量稍高，但用乙醇 (70%和50%乙醇)作溶劑時，梔子苷色譜峰形不對稱且峰形底較寬，影響積分的準確性，而用70%甲醇作溶劑時峰形較好，含量與用乙醇作溶劑的結果無顯著性差異。

另外，對加熱回流提取的時間進行考察，測定結果顯示20、30、40分鐘的回流時間對測定結果無顯著性影響，但為了提取更完全，回流時間選擇30分鐘為宜。

3.2 最大吸收波長的選擇

梔子苷對照品溶液及加流動相制成的對照品溶液(32μg/ml)，在200～400nm間進行紫外吸收光譜掃描，結果在240nm處有最大吸收，因此選擇240nm作為檢測波長。

本文采用HPLC法測定消腫止痛巴布膏中梔子苷的含量，方法快速，準確，結果可靠。

［1］中國藥典［S］.2010.