16s r DNA文庫法分析番石榴果實蠅共生菌組成

戴 陽， 李志紅＊， 柳麗君， 吳佳教， 鄧裕亮

（1．中國農業大學農學與生物技術學院，北京 100193； 2．廣東檢驗檢疫技術中心，廣州 510623；3．西雙版納出入境檢驗檢疫局，景洪 666100）

番石榴果實蠅［Bactrocer a correcta （Bezzi）］隸屬于雙翅目（Diptera），實蠅科（Tephritidae），寡鬃實蠅亞科（Dacinae），寡鬃實蠅族（Dacini），果實蠅屬（Bactr ocer a），是為害水果的一類重要經濟實蠅。番石榴果實蠅主要分布在亞洲的印度、巴基斯坦、泰國、尼泊爾、斯里蘭卡、緬甸、越南［1］，目前，該蟲在我國主要分布在臺灣和云南的局部地區［2－3］。2007年5月28日，農業部與國家質量監督檢驗檢疫總局公布《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》，將果實蠅屬列為檢疫性有害生物，而番石榴果實蠅是果實蠅屬中的重要種類。

共生菌是存在于昆蟲體內特定部位的微生物，可分為初級共生菌和次級共生菌。初級共生菌在宿主體內垂直傳遞并與宿主協同進化，次級共生菌同時存在垂直傳遞和水平傳遞［4］。共生菌通過生物合成為宿主提供必需的氨基酸等營養物質，幫助宿主降解有害物質［5－6］，在進化中趨向同寄主建立共生關系，許多共生菌還存在與宿主協同進化的現象［7－8］。隨著動物胃腸道微生態理論的發展，細菌和昆蟲宿主間廣泛存在的互利互惠關系不斷被發現［9］。近年來，國外研究者針對油橄欖實蠅［Bactrocer a oleae（Gmelin）］、地中海實蠅［Cer atitis capitata （Wiedemann）］等多種實蠅的共生菌展開研究。Kounatidis用16s r DNA文庫構建技術，通過油橄欖實蠅DNA提取、通用引物的PCR擴增及產物純化、克隆轉化、測序及比對，發現油橄欖實蠅的優勢共生菌為醋酸桿菌［10］，Daniela等通過解剖觀察，發現地中海實蠅的主要共生菌為聚團腸桿菌［11］，Capuzzo等人利用16s r RNA基因序列研究了油橄欖實蠅的共生菌，發現一種與宿主協同進化的共生菌并將其命名為“Cantidatus Er winia Dacicola”［12］。

本研究采用16s r DNA文庫構建技術及克隆測序方法，檢測了番石榴果實蠅室內種群共生菌的多樣性，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1．1 試驗材料及主要生化試劑

1.1.1 試驗材料

本研究所用的番石榴果實蠅樣品由廣東檢驗檢疫技術中心提供，為室內飼養。取雌蟲、雄蟲各1頭用于共生菌16s DNA文庫的構建。樣品浸存于無水乙醇中，－20℃保存備用。

1．1．2 主要試劑

血液／細胞／組織基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）、10×Taq Buffer（含15 mmol／L Mg Cl2）、2．5 mmol／L d NTPs、2．5 U／μL Taq DNA 聚合酶、D2000 DNA分子量標準、瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購自北京天根生化科技公司，p MD19－T載體購自寶生物工程（大連）有限公司，DH5α感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司，PCR引物由北京奧科生物技術公司合成。

1．2 16s r DNA文庫的建立

1．2．1 單頭實蠅基因組DNA提取

用無菌水將實蠅樣品快速洗凈后，采用 “血液／細胞／組織基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）”提取單頭實蠅成蟲樣品的基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測提取質量。

1．2．2 番石榴果實蠅共生菌16s r DNA序列擴增

參考Willam等的研究［13］，引物采用真細菌16S r DNA正向通用引物27 F；反向通用引物1492R．，該對通用引物可以從廣泛的真細菌中擴增出16S r DNA片段。50μL PCR反應體系包括：10×PCR緩沖液5．0μL（含15 mmol／L Mg Cl2），正反向引物（10μmol／L）各1．0μL，d NTPs（各2．5 mmol／L）4．0μL，DNA模板2．5μL，Taq酶1．2 U，加無菌水至50μL；熱循環程序為95℃5 min，接著進行35個循環（94℃3 min，55℃30 s，72℃1 min），最后在72℃反應10 min后結束。PCR擴增產物為各種真細菌16s r DNA片段的混合物。

表1 PCR引物信息

1．2．3 擴增產物純化及克隆

PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，在紫外凝膠成像儀下將目的條帶切下，采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收、純化。純化產物與p MD19－T載體于16℃連接過夜，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，藍白斑篩選陽性克隆。

1．2．4 菌落PCR驗證

采用菌落PCR驗證白色菌落是否為插入了目的片段的陽性克隆。25μL PCR反應體系包括：10×PCR緩沖液2．5μL（含15 mmol／L MgCl2），正反向引物（10μmol／L）各 0．2μL，d NTP（各2．5 mmol／L）2．0μL，Taq酶0．6U，加無菌水至25μL，挑取單個菌落作為DNA模板加入；熱循環程序為：95℃5 min，接著進行38個循環（94℃1 min，55℃1 min，72℃2 min），最后在72℃反應10 min后結束。PCR產物用1．5%的瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色10 min，紫外成像系統檢測。

1．2．5 限制性內切酶分析及測序

限制性內切酶為MspⅠ，反應體系為10μL，包括10×緩沖液1μL，PCR產物9μL，內切酶4 U，加去離子水至10μL，37℃溫浴過夜。酶切產物采用2%瓊脂糖冰浴電泳分離。

對酶切圖譜進行鑒定、比較，將酶切圖譜一致的歸為同一個分類操作單元OTU（operational taxonomic unit），挑取同一OTU的代表性克隆子送北京奧科公司進行雙向測序。將不同反應所獲得的序列進行拼接，獲得16s r DNA片段序列（約1．5 kb）。將拼接序列進行BLAST比對（http：∥www．ncbi．nl m．nih．gov／BLAST）。

2 結果及分析

2．1 番石榴果實蠅共生菌總DNA的PCR擴增

樣品總DNA的PCR擴增見圖1，通過PCR擴增獲得的條帶約為1．5 kb，且無非特異性條帶。得到的擴增產物經純化后用于16s r DNA文庫的建立。

圖1 番石榴果實蠅共生菌的16s r DNA擴增圖譜

2．2 番石榴果實蠅雄蟲共生菌及其分析

將酶切圖譜進行比較、分組，共獲得11個OTU，如圖2a所示，每一個類型選取一個代表性序列進行克隆測序并參考Kounatidis等人的方法統計豐度［10］，共 獲 得 11 條 16s r DNA 序 列，長 度 為1．5 kb左右。通過BLAST N搜索Gen Bank數據庫，選擇數據庫中相似性最高且至少大于95%的序列（表2）。相似度分別從95%到99%。從表2可以看出，番石榴果實蠅雄蟲共生菌包括假單胞菌屬（Pseudomonas）、腸桿菌屬（Enterobacter）、不動桿菌屬 （Acinetobacter）、寡 養 單 胞 菌 屬 （Stenotr ophomonas）、脂環酸芽胞桿菌屬（Alicyclobacill us）、黃桿菌 科 （Flavobacteriaceae）、乳 球 菌屬 （Lactococcus）、噬酸菌屬（Acidovor ax）、Orbus菌屬以及檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）。其中假單胞菌有2種，其他共生菌各1種。在這10個屬（科）中，乳球菌屬和假單胞菌屬占了50%左右，其中乳球菌約為23．6%，假單胞菌約為26．4%。

2．3 番石榴果實蠅雌蟲共生菌及其分析

將番石榴果實蠅雌蟲共生菌文庫中的13個OTU選取代表性序列進行測序，去掉空載體及無效序列，共得13條16s r DNA序列。通過BLAST N搜索GenBank數據庫，選擇數據庫中相似性最高的序列（表3），相似度從91%到99%。從表3可以看出，番石榴實蠅雌蟲共生菌屬于假單胞菌屬（Pseudomonas）、腸桿菌屬（Enterobacter）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、叢毛單胞菌屬（Comamonas）、蒼白桿菌屬（Ochrobactr um）、寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas）、脫硫弧菌屬（Desul f ovibrio）、醋桿菌屬（Acetobacter）。其中腸桿菌屬有5種，醋桿菌屬有3種，其他屬的細菌各1種。腸桿菌屬是優勢共生菌，約占33．9%。

圖2 共生菌文庫中部分克隆子RFLP結果

表2 番石榴果實蠅（雄）廣州種群共生菌組成和相對豐度1）

表3 番石榴果實蠅（雌）廣州種群共生菌組成和相對豐度

3 討論

本研究在番石榴果實蠅雄蟲中鑒定了11種細菌，隸屬于假單胞菌屬、腸桿菌屬、不動桿菌屬、寡養單胞菌屬、脂環酸芽胞桿菌屬、黃桿菌科、乳球菌屬、噬酸菌屬、Orbus菌屬以及檸檬酸桿菌屬，表明了番石榴果實蠅中存在多種共生菌。番石榴果實蠅雄蟲體內豐度較高的假單胞菌在地中海實蠅和油橄欖實蠅中也曾被發現過［10，14］，但并非優勢菌。而另外一種豐度較高的乳球菌則未有文獻報道。另外，墨西哥實蠅中也曾發現過檸檬酸桿菌［15－16］。

本研究在番石榴果實蠅雌蟲中檢測到了13種細菌，隸屬于假單胞菌屬、腸桿菌屬、不動桿菌屬、叢毛單胞菌屬、蒼白桿菌屬、寡養單胞菌屬、脫硫弧菌屬、醋桿菌屬。其中腸桿菌屬和醋酸桿菌為優勢共生菌。

研究表明初級共生菌與次級共生菌相比GC含量較低，這有利于基因的快速進化［17］，如尖音庫蚊（Culex pipiens）感染的Wol bachia，其16s r DNA序列的GC含量為46．6%［18］，阮永明檢測的B型煙粉虱初級共生菌16s r DNA序列，GC含量為48．2%，次級共生菌為54．1%［19］；李正西研究桃蚜初生共生菌，發現其16s r DNA序列GC含量為49．5%，而次生共生菌為55．5%［20］。本研究鑒定的細菌序列中，GC含量最低為51．0%，多數接近自由生活的細菌。據此可以推測本研究鑒定的細菌均為次級共生菌。

腸桿菌科在實蠅共生菌中具有重要地位，Daniela在地中海實蠅中發現了克雷伯氏菌和腸桿菌［11］，繞實蠅屬、按實蠅屬和果實蠅屬中都有腸桿菌存在［12，16，21］。

次級共生菌部分來自于垂直傳遞，部分來自于不同寄主的水平傳遞。受環境影響，昆蟲的次級共生菌不如初級共生菌穩定，容易發生改變。如腸桿菌科細菌多存在昆蟲腸道中，隨取食而攝取，隨糞便而排出［20］。但這并不能排除與宿主協同進化的共生菌的存在。

本研究在雄蟲中發現豐度較高的綠膿假單胞菌和豐度較低的腸桿菌屬細菌，而在雌蟲中這一結果正好相反。Behar等在地中海實蠅中同樣也分離出綠膿假單胞菌P．aer uginosa。該菌具有致病性，能降低宿主昆蟲的壽命［14］。腸桿菌科細菌具有拮抗致病菌、降解有毒物質、增加宿主適應性的功能，另外，腸桿菌還能夠促進宿主的碳氮代謝循環［22］。假單胞菌和腸桿菌互為消長，這與兩類細菌的生理學功能相吻合。食物對昆蟲腸道的微生物影響比較復雜，不同的食物可能會影響共生菌的組成［23］。有人認為在野生狀態下，昆蟲攝取的果實中含有的次生代謝物質會具有一定的殺菌作用，可能會影響腸道共生菌，尤其傾向選擇某些有解毒功能的細菌［24］。蟑螂在取食低蛋白、高纖維食物時，前腸的鏈球菌（Streptococci）和乳桿菌（Lactobacilli）數量減少，高蛋白的食物則導致H2和CO2產量減少以及G＋C細菌增多［25］。因此筆者估計飼養種群與野外種群的共生菌多樣性可能存在差異。

目前針對昆蟲共生菌的分離鑒定研究方法主要有3種，即傳統的分離培養鑒定法、顯微觀察法和以變性梯度凝膠電泳（PCR－DGGE）和16s r DNA文庫構建為主的分子生物學方法。相比傳統的微生物學方法，分子生物學方法能全面獲得共生菌的信息，而且不受細菌是否可培養的限制。本研究采用的16s r DNA文庫構建和測序方法，不僅獲得序列信息比PCR－DGGE更為豐富，還能評估各細菌的豐度，且不需要昂貴的儀器設備［26］。

研究結果為探索番石榴果實蠅共生菌的生理功能及其與宿主的協同進化關系提供了基礎。在明確共生菌多樣性的基礎上，結合相關文獻報道，選取對番石榴果實蠅入侵起正作用的共生菌開展研究。針對可培養細菌，通過高溫或抗生素去除共生菌，然后通過飼喂或顯微注射導入，通過生物學試驗明確共生菌對寄主的生理功能，可以明確共生菌對番石榴果實蠅的生物學功能，并進一步揭示番石榴果實蠅和共生菌協同、快速入侵的機制。

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