白僵菌培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)對(duì)蛋白酶（cdep1）、幾丁質(zhì)酶（chit1）基因表達(dá)的影響

孫召朋， 張正坤， 徐文靜， 汪洋洲， 潘洪玉， 李啟云＊

（1．吉林大學(xué)，長(zhǎng)春 130062； 2．吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，長(zhǎng)春 130033）

白僵菌（Beauveria bassiana）是目前國(guó)內(nèi)生物防治中應(yīng)用最廣泛的昆蟲(chóng)病原真菌［1］，具有防治害蟲(chóng)效果好，不傷害天敵，對(duì)人、畜、植物無(wú)毒害，容易大量生產(chǎn)，無(wú)殘毒，害蟲(chóng)不易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn)［2］，在玉米螟和松毛蟲(chóng)等的防治中已取得很好的防效［3］。研究表明，在穿透寄主體壁的過(guò)程中，球孢白僵菌會(huì)產(chǎn)生多種降解酶。在穿透昆蟲(chóng)體壁的早期，昆蟲(chóng)病原真菌高水平表達(dá)蛋白酶，降解昆蟲(chóng)的體表蛋白［4］。同時(shí)，也表達(dá)用于降解昆蟲(chóng)體壁的主要組成成分幾丁質(zhì)的幾丁質(zhì)酶［5］。球孢白僵菌在防治應(yīng)用中菌種資源主要來(lái)源于自然直接篩選的菌株，生產(chǎn)的菌株“退化”是防效不穩(wěn)定的重要原因之一。高毒力菌株經(jīng)多代培養(yǎng)后毒力退化的現(xiàn)象已被認(rèn)識(shí)［6］，但原因不是十分清楚。本研究對(duì)兩株田間采集分離的野生白僵菌菌株進(jìn)行了培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)，通過(guò)對(duì)亞洲玉米螟的室內(nèi)毒力測(cè)定，評(píng)價(jià)了繼代培養(yǎng)對(duì)白僵菌毒力的影響。同時(shí)，明確了每一世代白僵菌蛋白酶和幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)水平，分析了繼代培養(yǎng)對(duì)白僵菌毒力及其蛋白酶和幾丁質(zhì)酶基因的影響。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

供試?yán)ハx(chóng)：亞洲玉米螟公主嶺種群［Ostrinia f ur nacalis（Guenée）］2齡幼蟲(chóng)，由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所汪洋洲博士提供。

供試菌株：球孢白僵菌D1－5和D6－2分離自德惠市玉米田的玉米螟僵蟲(chóng)蟲(chóng)體，由本實(shí)驗(yàn)室沙土管保存于－80℃超低溫冰箱（Ther mo For ma）。

1．2 主要試劑

限制性核酸內(nèi)切酶Eco RⅠ、Hin dⅢ購(gòu)自MBI Fer mentas，Trizol reagent購(gòu)自上海生工，瓊脂糖為Bio－Rad公司產(chǎn)品，總RNA抽提試劑盒為大連寶生物工程有限公司（Ta Ka Ra）產(chǎn)品。所用無(wú)水乙醇、異丙醇、氯仿等有機(jī)溶劑為中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）上海化學(xué)試劑公司產(chǎn)品，均為分析純。

1．3 室內(nèi)毒力測(cè)定

1．3．1 白僵菌供試菌株的繼代培養(yǎng)

將供試菌株在無(wú)菌條件下從沙土管接種在SDAY培養(yǎng)基（質(zhì)量濃度4%）葡萄糖，1%蛋白胨，2%酵母膏，p H7．0），為F1代，培養(yǎng)20 d左右后刮取孢子，將孢子制備成1×107個(gè)／mL濃度的孢子懸液，涂布于SDAY培養(yǎng)基，共進(jìn)行F2～F5代培養(yǎng)，每個(gè)菌株各世代培養(yǎng)10皿，收集每個(gè)世代孢子，均配制成1×107孢子／mL濃度的孢子懸浮液供試。

1．3．2 萌發(fā)率的測(cè)定

取相同量菌懸液接種于SDAY培養(yǎng)基中（終濃度為1×105孢子／mL），26℃培養(yǎng)16 h，測(cè)其萌發(fā)率，每個(gè)菌株重復(fù)3次。

1．3．3 室內(nèi)生物測(cè)定方法

將室內(nèi)飼養(yǎng)、齡期一致的2齡玉米螟幼蟲(chóng)浸入1×107孢子／mL的孢子懸液中5～10 s后，用濾紙吸去多余藥液，將試蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到正常條件下飼養(yǎng)。每處理4次重復(fù)，每重復(fù)浸蟲(chóng)20頭，并設(shè)無(wú)菌水處理作為對(duì)照。在黑暗環(huán)境下培養(yǎng)10 d，每天記錄被白僵菌感染的試蟲(chóng)數(shù)。

1．3．4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析方法

根據(jù)調(diào)查數(shù)據(jù)，計(jì)算各處理的校正死亡率，公式如下：

死亡率（P1）＝死亡蟲(chóng)數(shù)（K）／處理總蟲(chóng)數(shù)（N）×100%；

校正死亡率（P2）＝［處理死亡率（Pt）－空白對(duì)照死亡率（P0）］／［1－空白對(duì)照死亡率（P0）］；

利用DPS分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。

1．4 半定量RT－PCR檢測(cè)繼代培養(yǎng)對(duì)白僵菌蛋白酶、幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)的影響

1．4．2 樣品收集及總RNA提取

從培養(yǎng)供試菌株的PDA培養(yǎng)基上刮取100 mg分生孢子，采用Trizol法提取總RNA。利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定各處理中總RNA的濃度，并保證A260／A280比值在 1．8～2．0之間，以確保總 RNA純度。

1．4．2 半定量 RT－PCR［7－11］

利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品RNA濃度，每個(gè)處理上樣量為50 ng總RNA，利用蛋白酶（cdep1）（AY040532．1）、幾丁質(zhì)酶（chit1）（AY145－440．1）及管家基因18S r DNA（GQ302680．1）特異性引物進(jìn)行c DNA第1鏈合成。以各基因c DNA第1鏈為模板進(jìn)行目的片段PCR，反應(yīng)中調(diào)整反應(yīng)循環(huán)數(shù)，以10、15、20個(gè)循環(huán)每隔5個(gè)循環(huán)進(jìn)行一次反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件為以目的基因條帶指數(shù)增長(zhǎng)期循環(huán)數(shù)為準(zhǔn)確定基因表達(dá)量的差異。各基因PCR反應(yīng)體系為：2μL c DNA產(chǎn)物，0．5μL Taq DNA聚合酶，目的基因（或18Sr DNA基因）上下游引物各1μL，d NTPs 1μL，10×buffer 5μL，Mg Cl2（25 mmol／L）3μL，終體積50μL。反應(yīng)程序如下：94℃2 min，94℃50 s，58℃（cdep1）／52 ℃ （chit1）／58 ℃（18S r DNA）50 s，72 ℃ 1 min （10、15、20、25個(gè)循環(huán)），72℃10 min。4℃保存。

表1 待測(cè)基因所用引物序列

根據(jù)上述PCR反應(yīng)結(jié)果確定各基因擴(kuò)增指數(shù)期循環(huán)數(shù)，以供試菌株不同世代各基因c DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳膠濃度1．5%。

2 結(jié)果與分析

2．1 繼代培養(yǎng)對(duì)白僵菌孢子萌發(fā)率的影響

兩菌株在SDAY培養(yǎng)基中經(jīng)16 h培養(yǎng)后，其萌發(fā)率如圖1所示。兩個(gè)菌株的萌發(fā)率變化規(guī)律基本相似，F(xiàn)2代萌發(fā)率明顯高于F1代，分別達(dá)到77%和70%，在隨后的繼代培養(yǎng)中，F(xiàn)3、F4、F5代萌發(fā)率依次降低，L1－1的F5代萌發(fā)率僅為2%。

圖1 供試白僵菌菌株不同世代萌發(fā)率測(cè)定（p＝0．05）

2．2 繼代培養(yǎng)對(duì)白僵菌殺玉米螟毒力的影響

白僵菌兩菌株不同世代對(duì)亞洲玉米螟2齡幼蟲(chóng)的毒力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2和表3。菌株L1－1 F1代孢子對(duì)亞洲玉米螟的致死中時(shí)（LT50）和致死90%時(shí)間（LT90）分別為186．63 h和284．16 h，而F2代孢子分別為180．61 h和209．61 h，明顯低于F 1代，而F3～F5代孢子的LT50和LT90逐漸增加，明顯高于F2代和F1代，說(shuō)明其毒力在不斷下降。D6－2菌株F1代孢子對(duì)亞洲玉米螟的LT50和LT90分別為170．09 h和190．21 h，而 F2代分別為137．70 h和165．84 h，明顯低于F1代，而F3～F5代孢子的LT50和LT90逐漸增加，明顯高于F2代和F1代，說(shuō)明隨著繼代次數(shù)的增加其毒力也在不斷下降。

表2 白僵菌L1－1菌株不同世代對(duì)亞洲玉米螟2齡幼蟲(chóng)的毒力（10 7孢子／mL）

表3 白僵菌D6－2菌株不同世代對(duì)亞洲玉米螟2齡幼蟲(chóng)的毒力（10 7孢子／mL）

2．3 繼代培養(yǎng)對(duì)白僵菌毒力相關(guān)基因表達(dá)的影響

2．3．1 RT－PCR 反應(yīng)循環(huán)數(shù)的確定

利用供試菌株目的基因和管家基因c DNA第1鏈為模板，進(jìn)行目的基因半定量RT－PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)的確定。從圖2中可以看出，18S r DNA基因和chit 1基因在15～20個(gè)循環(huán)時(shí)條帶差異明顯，而cdep 1基因在10～15個(gè)循環(huán)時(shí)條帶差異明顯，因此，以18個(gè)循環(huán)為18S r DNA基因和chit 1基因的檢測(cè)循環(huán)數(shù)，以13個(gè)循環(huán)作為cdep1基因的檢測(cè)循環(huán)數(shù)。

圖2 管家基因及毒力相關(guān)基因半定量RT－PCR循環(huán)數(shù)的確定

2．3．2 目的基因的半定量RT－PCR檢測(cè)

為了明確繼代培養(yǎng)對(duì)球孢白僵菌毒力相關(guān)酶基因表達(dá)情況的影響，以18Sr DNA基因?yàn)閮?nèi)參，利用半定量RT－PCR對(duì)cdep 1基因和chit 1基因的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)。從圖3可以看出，在內(nèi)參基因穩(wěn)定表達(dá)，也就是總RNA量相同的情況下，兩個(gè)供試菌株L1－1和D6－2的cdep 1基因和chit1基因在F 1和F2代表達(dá)穩(wěn)定，隨著繼代次數(shù)的增多，供試菌株兩個(gè)基因的PCR條帶明顯變?nèi)酰f(shuō)明其表達(dá)量在不斷下降，這與對(duì)亞洲玉米螟毒力測(cè)試的結(jié)果一致。

圖3 繼代培養(yǎng)對(duì)球孢白僵菌毒力相關(guān)酶基因cdep1和chit1基因mRNA表達(dá)的影響

3 討論

毒力測(cè)定結(jié)果表明，兩株白僵菌供試菌株的F2代比F1代對(duì)亞洲玉米螟2齡幼蟲(chóng)的毒力有所增強(qiáng)，而F3～F5代對(duì)玉米螟的毒力呈下降趨勢(shì)。球孢白僵菌通過(guò)分泌蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和脂酶來(lái)降解昆蟲(chóng)體壁，其中幾丁質(zhì)酶和蛋白酶具有重要作用［12－14］。本研究利用半定量RT－PCR方法對(duì)兩株白僵菌中兩種毒力相關(guān)酶基因在不同世代的表達(dá)情況進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)隨著繼代次數(shù)的增多，供試菌株兩個(gè)毒力相關(guān)酶基因的表達(dá)量均呈下降趨勢(shì)，與對(duì)亞洲玉米螟毒力測(cè)定結(jié)果一致。出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是由于F1代直接接種于沙土管，菌株并沒(méi)有表現(xiàn)出很高的萌發(fā)率和毒力，在F1活化之后，F(xiàn)2代達(dá)到其毒力最大值，F(xiàn)3～F5依次減弱。

在白僵菌繼代培養(yǎng)過(guò)程中，隨著繼代次數(shù)的增多，會(huì)有多個(gè)生物性狀發(fā)生改變。P．Rajanikant h等［15］報(bào)道繼代培養(yǎng)對(duì)產(chǎn)孢量和毒力有很大的影響。唐曉慶等［6］報(bào)道了繼代培養(yǎng)中菌落都會(huì)發(fā)生變化，并提出了菌落局變發(fā)生的幾種可能的遺傳機(jī)制。唐曉慶等人［16］報(bào)道了繼代培養(yǎng)對(duì)抗旱力的影響，結(jié)果顯示繼代培養(yǎng)能增強(qiáng)菌株的抗旱力，但菌株生活力減弱。樊美珍等［17］通過(guò)研究證明，以SDAY為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的不同C／N比、不同p H培養(yǎng)基中，均未發(fā)現(xiàn)菌落局變及菌種退化，SDAY最適于白僵菌生長(zhǎng)。本試驗(yàn)中采用SDAY為培養(yǎng)基研究供試白僵菌菌株萌發(fā)率、毒力及其相關(guān)酶基因的表達(dá)，結(jié)果表明這些指標(biāo)均發(fā)生了變化，并且表現(xiàn)出相似的變化規(guī)律。F1與F2代各項(xiàng)指標(biāo)基本相似或者略低于F 2代，從F2代開(kāi)始到F5代，萌發(fā)率、毒力及其相關(guān)酶基因的表達(dá)呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，這和唐曉慶等人所報(bào)道的繼代培養(yǎng)中產(chǎn)生不同類(lèi)型的分離株，這些分離株多表現(xiàn)為產(chǎn)孢量下降、毒力降低等與生產(chǎn)性狀退化類(lèi)似的變異現(xiàn)象基本相符［18］。其可能的原因是由于F1剛從沙土管中接出，菌株新陳代謝能力下降，經(jīng)過(guò)相當(dāng)于活化階段的F1代后，在F2代各種指標(biāo)都達(dá)到最大值，從F2代到F5代的繼代培養(yǎng)，菌株毒力相關(guān)酶基因表達(dá)量逐漸降低，從而導(dǎo)致了毒力的下降。Ansari等［19］對(duì)另一廣泛應(yīng)用的生防真菌綠僵菌（Metar hiziu m anisopliae）的3株商業(yè)化菌株進(jìn)行了12代的繼代培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其毒力并未發(fā)生變化，并將其作為綠僵菌高效菌株的篩選標(biāo)準(zhǔn)。生防真菌的毒力在繼代培養(yǎng)過(guò)程中可能依賴(lài)其自身的遺傳背景，本研究中只對(duì)兩株白僵菌菌株進(jìn)行了繼代培養(yǎng)對(duì)毒力及毒力相關(guān)因素的影響，是否在白僵菌中存在經(jīng)繼代培養(yǎng)而毒力不發(fā)生變化的菌株，還需要進(jìn)一步研究。

由于白僵菌對(duì)靶標(biāo)昆蟲(chóng)的致病力由多種因素造成［6］，本研究只是從蛋白酶和幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)方面進(jìn)行了研究，關(guān)于其他影響因素如萌發(fā)率、毒素代謝水平等還需進(jìn)一步研究。同時(shí)，在菌種使用過(guò)程中，定期進(jìn)行蟲(chóng)體復(fù)壯，可以恢復(fù)菌株毒力這一問(wèn)題上存在爭(zhēng)論［20］，本試驗(yàn)只對(duì)培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)白僵菌毒力退化情況進(jìn)行了測(cè)定，對(duì)于通過(guò)蟲(chóng)體進(jìn)行菌株復(fù)壯并未研究，后者可作為以后研究的新方向。

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