糖絡寧對糖尿病大鼠背根神經節細胞凋亡的影響*

朱智耀，高彥彬，鄒大威，李步滿，彭繼升

糖尿病周圍神經病變(Diabetic peripheral neuropathy DPN)是糖尿病常見的慢性并發癥之一。其發病機制目前有多種學說，其中氧化應激引起的細胞凋亡在DPN的發生發展中發揮重要作用［1-3］。中藥復方糖絡寧治療DPN的療效在臨床和實驗研究中已得到初步證實［4-8］。本實驗通過觀察糖絡寧對糖尿病大鼠背根神經節(DRG)細胞凋亡、半胱天冬酶-3(Caspase-3)蛋白表達的影響，進一步探討其治療DPN的作用機制，為更好地指導臨床用藥提供理論及實驗依據。

1 材料

1.1 動物

SPF/VAF級雄性8周齡 SD大鼠，體重180g～220g，由北京維通利華實驗動物公司提供。分籠飼養于北京中醫藥大學屏障環境動物實驗室，環境溫度控制在 20℃ ～25℃，相對濕度 40% ～70%，12/12h光照/黑暗循環。實驗期間大鼠自由進水和進食。

1.2 藥物

中藥制劑糖絡寧浸膏(主藥為生黃芪、生地、牛膝、狗脊、丹參、川芎等)由北京中醫藥大學東方醫院制劑中心提供，1ml浸膏含生藥3g。

1.3 試劑

鏈脲佐菌素為美國 Sigma公司，兔抗大鼠Caspase-3多克隆抗體為美國 Cell Signaling Technology公司產品，原位細胞凋亡檢測試劑盒為Roche公司產品(天津灝洋生物分裝)，兩步法免疫組化檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒、Mayor，s蘇木素均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.4 儀器

Olympus BX51顯微鏡、Olympus DP71攝像系統、穩豪血糖儀以及血糖試紙(美國LifeScan，Inc)。

2 方法

2.1 模型建立與分組處理

選用雄性SD大鼠適應性喂養1周，隨機選擇8只為正常對照(control)組，其余大鼠禁食不禁水12h后，將鏈脲佐菌素(STZ)溶入檸檬酸緩沖液(p H值=4.2～4.5)配制成1%的溶液，按60mg/kg給予一次性腹腔注射(control組大鼠注射等體積的檸檬酸緩沖液)。72h后大鼠禁食8h斷尾取血，測血糖≥16.7mmol/L視為糖尿病造模成功，造模成功大鼠隨機分為模型組(model)、糖絡寧組(TLN)，每組8只，隨即開始灌胃。糖絡寧組按生藥10g/(kg·d)灌胃，模型組給予等量蒸餾水灌胃，連續給藥32周。

2.2 一般情況觀察與血糖測定

觀察各組大鼠毛色、精神狀態、攝食量、飲水量、尿量、日常活動情況等;禁食8h后尾靜脈采血，4周測定1次血糖。

2.3 免疫組化檢測DRG中Caspase-3表達

切片脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育10min，以消除內源性過氧化物酶的活性。蒸餾水沖洗后滴加封閉液，室溫孵育10 min甩去多余液體。滴加1∶150稀釋的一抗(Caspase-3多克隆抗體)，4℃過夜(并同時用PBS代替一抗作為陰性對照)。次日PBS沖洗，滴加聚合HRP標記抗兔IgG，37℃孵育30 min，PBS沖洗，DAB顯色，自來水充分沖洗，蘇木素復染、脫水透明、封片。從Caspase-3在背根神經節中表達結果判斷，清晰的背景上胞質和(或)核棕黃色為陽性表達，陰性對照無特異性著色。

2.4 DNA末端標記法(TUNEL)檢測細胞凋亡

切片脫蠟至水，蛋白酶 K室溫消化30min后，PBS洗片，與阻斷劑(0.3%H2O2甲醇溶液)室溫孵育30 min，PBS洗片。滴加50ul的 TUNEL反應混合溶液，在濕盒中37℃孵育60 min，PBS沖洗后加入50ul轉化劑-POD，在濕盒中 37℃孵育 30 min，PBS沖洗3次，DAB顯色，蘇木素復染，脫水透明、封片。光鏡下觀察細胞核中出現棕黃色顆粒者為TUNEL染色陽性細胞。

2.5 圖像分析

每張切片在400倍光鏡下選取4個互不重疊的視野，使用Image Pro-Plus 5.0.1圖像分析軟件半定量測定每個視野中所有陽性像素的積分光密度值(IOD)，取均值為Caspase-3的結果;TUNEL結果用凋亡神經元的陽性百分率表示，取均值為TUNEL的結果。

2.6 統計學分析

計量資料以均數±標準差(珋x±s)表示，多組均數比較采用方差分析，所有數據均經SPSS13.0軟件處理，P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠一般情況觀察

正常組大鼠精神狀態良好，毛色有光澤，進食和飲水量以及尿量都正常，體重增加明顯，活動自如。模型組大鼠進食和飲水量以及尿量都明顯增多，神態萎靡，毛豎無光澤，尾巴蒼白濕冷，蜷臥拱背，活動少，體重增長緩慢。糖絡寧治療組的大鼠表現與模型組類似，但程度較輕。

3.2 糖絡寧對大鼠血糖值的影響

表1顯示，與正常對照組比較，造模后大鼠血糖明顯升高(P＜0.05)，同時在未進行糖絡寧干預前(0周)，TLN組與模型組血糖值無差異(P＞0.05)。在TLN干預8周后大鼠血糖開始下降，與模型組相比有統計學差異(P＜0.05)。

表1 糖絡寧對大鼠血糖值的影響

3.3 糖絡寧對大鼠背根神經節神經元凋亡陽性率的影響

表2圖1顯示，模型組背根神經節神經元的凋亡率與正常對照組相比明顯增加，有統計學差異(P＜0.05);糖絡寧組的凋亡率低于模型組，有統計學差異(P＜0.05)。

圖1 背根神經節TUNEL染色圖片(×400)

3.4 糖絡寧對大鼠背根神經節Caspase-3蛋白表達的影響

表2圖2顯示，Caspase-3免疫組織化學染色顯示在正常大鼠背根神經節中僅有少量陽性反應。模型組染色呈強陽性反應，棕黃色顆粒狀彌漫分布于胞漿中。經圖像分析處理，模型組積分光密度值與正常對照組相比明顯增多，有統計學差異(P＜0.05)。糖絡寧干預后，大鼠背根神經節Caspase-3的表達減少，其積分光密度值與模型組比較有統計學差異(P＜0.05)。

4 討論

細胞凋亡主要通路分別為死亡受體介導的凋亡途徑(外在途徑)和線粒體凋亡途徑(內在途徑)［9］，內外途徑都是通過激活caspase家族引起細胞凋亡，在caspase蛋白家族中caspase-3又是研究的焦點，幾乎有關caspase的所有凋亡途徑最終都是通過激活caspase-3導致細胞凋亡［10］。Caspase-3酶原激活后可切割不同底物，形成蛋白酶級聯切割放大機制，最終導致細胞凋亡形態學和生化特征的形成。細胞凋亡的生化學特征主要是細胞核內的染色質在核小體間斷裂［11］，產生若干大小不一的寡核苷酸片段。TUNEL檢測是1種將細胞凋亡時DNA斷端進行標記的方法，它的檢測原理是熒光素標記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶的作用下連接到凋亡細胞中斷裂DNA的3-OH末端，而熒光素能被結合有過氧化物酶的抗熒光素抗體識別，最后利用過氧化物酶與其底物反應而標記出凋亡的細胞核。該方法是最為常用的檢測凋亡手段之一，優點是靈敏度高，特異性強，可原位顯示凋亡細胞及其分布。

表2 糖絡寧對大鼠背根神經節神經元凋亡陽性率及Caspase-3蛋白表達的影響

圖2 背根神經節Caspase-3蛋白表達圖片(×400)

糖尿病周圍神經病變是多因素共同作用的結果，細胞凋亡在DPN的發生發展中發揮重要作用。關于DPN細胞凋亡的研究主要集中在背根神經節和坐骨神經，本研究以背根神經節為主。Srinivasan等［12］認為，糖尿病大鼠背根神經節細胞凋亡的增加是DPN的致病因素。Schmeichel等［13］研究也發現，糖尿病大鼠隨病程的延長，DRG神經元凋亡率逐漸上升，且Caspase-3蛋白表達和DRG神經元凋亡與DNA氧化損傷存在明顯相關性，支持氧化損傷導致細胞凋亡。另外，通過體外對DRG神經元的培養發現，隨著培養基中葡萄糖增加，神經突的退變和細胞凋亡增加［14］。在本實驗中，模型組同樣也出現DRG中Caspase-3表達增加、神經元凋亡率上升的現象，在應用糖絡寧干預后細胞凋亡有明顯改善，提示糖絡寧有抑制凋亡的作用。另外，本實驗還觀察到糖絡寧有一定降低大鼠血糖的功效。

現代醫學對于DPN的治療尚無理想方法。糖絡寧以生黃芪、生地、牛膝、狗脊、丹參、川芎等為主要組成，具有益氣養陰、滋補肝腎、活血通絡之效。經多年臨床驗證，可以明顯改善患者肢體麻木、疼痛、反射減弱等神經系統癥狀，對神經傳導速度、末梢微循環積分以及患者氧化應激狀態均有改善作用，在治療過程中未見明顯的不良反應［4、5］。同時動物實驗證明，糖絡寧可有效提高糖尿病大鼠坐骨神經傳導速度，改善糖尿病大鼠的痛覺異常以及氧化應激狀態［6、8］。本實驗結果表明，糖絡寧能抑制DRG中神經元凋亡，從而起到神經保護作用，這可能為DPN治療提供新思路，為DPN臨床防治用藥提供實驗依據，但糖絡寧是通過何種凋亡通路發揮作用有待進一步研究。

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