Livin、Caspase-3和PCNA在子宮頸鱗狀細(xì)胞癌癌變中的表達(dá)及意義

毛麗梅 王向紅 李麗華 李翠芹 王文立 王亞凡

Livin作為凋亡抑制基因，它的異常表達(dá)使細(xì)胞的正常凋亡機(jī)制受損，從而導(dǎo)致有惡變潛能的細(xì)胞積累，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。Livin含有IAPs家族成員特有的BIR和RING指結(jié)構(gòu)域，它與Caspases蛋白結(jié)合，抑制其介導(dǎo)級(jí)聯(lián)激活反應(yīng)引起細(xì)胞凋亡，Caspase-3是Caspase家族中最重要的凋亡執(zhí)行者之一，全部或部分負(fù)責(zé)大量底物的蛋白水解，抑制Caspase-3的活性或拮抗其功能可使細(xì)胞凋亡受抑。由于Livin能夠在一些腫瘤中特異性高表達(dá)，因此研究其結(jié)構(gòu)和功能為抗腫瘤藥物篩選、癌癥的治療有重要意義。目前，筆者見到的國內(nèi)有關(guān)Livin在正常宮頸鱗狀上皮、宮頸上皮內(nèi)瘤變、宮頸鱗癌中的表達(dá)情況報(bào)道很少，且Livin、Caspase-3和PCNA在宮頸鱗癌癌變發(fā)生發(fā)展過程中的作用尚不清楚。本研究擬以免疫組化法探討正常宮頸鱗狀上皮、宮頸上皮內(nèi)瘤變、宮頸鱗癌中Livin、Caspase-3和PCNA的表達(dá)情況，以期進(jìn)一步探討宮頸鱗癌的發(fā)病機(jī)制，為宮頸鱗癌的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集 選擇我院2004至2010年存檔蠟塊。其中正常宮頸鱗狀上皮22例，宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)75例，宮頸鱗癌42例(其中高中分化22例、低分化20例;年齡＜50歲29例，≥50歲13例;腫瘤直徑≥3 cm者18例，＜3 cm者24例;臨床分期:Ⅰa～Ⅰb期30例，Ⅰa～Ⅱb期12例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者8例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者34例)。

1.2 方法 由2位有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師對全部病例的所有切片進(jìn)行復(fù)查。CIN分級(jí)按WHO腫瘤病理與遺傳學(xué)分類［1］，組織學(xué)分級(jí)(按Broder的宮頸癌分類標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)［2］)、臨床分期(按1995年FIGO分期［3］)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷。采用免疫組化法，一抗為鼠抗人Livin單克隆抗體(美國Imgenex公司生產(chǎn))，工作濃度均為1∶150。實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。將已知的乳腺癌切片作為陽性對照，陰性對照以PBS替代一抗。

1.3 結(jié)果判定 按照半定量積分方法，每例均隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野(×400)，進(jìn)行半定量積分判斷結(jié)果:陽性細(xì)胞≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為 3分，＞75%為4分;陽性強(qiáng)度黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將細(xì)胞陽性率與染色強(qiáng)度兩者積分相乘:0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為中度陽性(++)，9～12分為強(qiáng)陽性(+++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)及相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

Livin在子宮頸鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)與腫瘤分化程度密切相關(guān)，高、中分化鱗癌組織Livin陽性表達(dá)率明顯低于低分化鱗狀細(xì)胞癌(χ2=6.453，P＜0.05)。Livin的表達(dá)與淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，有淋巴轉(zhuǎn)移的宮頸鱗狀細(xì)胞癌的Livin的陽性表達(dá)率明顯高于無淋巴轉(zhuǎn)移(χ2=3.953，P＜0.05)。而與年齡、腫瘤大小、臨床分期無相關(guān)關(guān)系(P＞0.05)。Caspase-3在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)與腫瘤分化程度密切相關(guān)，高中分化鱗癌組織Livin陽性表達(dá)率明顯高于低分化鱗狀細(xì)胞癌(χ2=7.832，P＜0.05)。而與年齡、腫瘤大小、臨床分期及淋巴轉(zhuǎn)移無相關(guān)關(guān)系(P＞0.05)。PCNA在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組和CIN組PCNA的陽性表達(dá)明顯高于正常組，但其表達(dá)與年齡、腫瘤大小、分化程度、臨床分期及淋巴轉(zhuǎn)移均無關(guān)(P＞0.05)。見表1。

表1 Livin、Caspase-3和PCNA在宮頸鱗癌中的表達(dá)及與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 例

3 討論

凋亡抑制蛋白是一類內(nèi)源性細(xì)胞凋亡抑制因子，在很多物種中起著抑制凋亡的作用，其過度表達(dá)引起細(xì)胞凋亡不足與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Livin基因是一種新發(fā)現(xiàn)的IAP成員［4］，基因位于人染色體20 q13.3，全長4.6 kb，包含7個(gè)外顯子及6個(gè)內(nèi)含子，其基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有2種mRNA亞型，分別編碼298個(gè)氨基酸蛋白質(zhì)(α)和280個(gè)氨基酸蛋白質(zhì)(β)，Livin蛋白N端僅包含一個(gè)BIR結(jié)構(gòu)，C端含一個(gè)RING環(huán)指結(jié)構(gòu)。Livin基因只在黑色素瘤、結(jié)腸癌、前列腺腺癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌、非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)等腫瘤細(xì)胞中及在胎盤、胚胎組織中表達(dá)，在多數(shù)正常成人組織中不表達(dá)。這一表達(dá)的特異性使得Livin基因成為目前國際研究的熱點(diǎn)［5］。

Livin蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)［6］。而Ka等［7］對胎盤、滋養(yǎng)層細(xì)胞和絨毛膜癌細(xì)胞系染色，陽性顯色僅定位于胞核。Vucic等［8］研究發(fā)現(xiàn)Livin在細(xì)胞中主要表達(dá)于胞質(zhì)而不是紡錘體上，但Kasof等［9］認(rèn)為Livin細(xì)胞分布與Survivin相似，即可在胞質(zhì)和胞核內(nèi)呈纖維絲狀表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)中其陽性顯色位于腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)和核內(nèi)，這與Kasof等［9］結(jié)果是一致的。

Livin抑制細(xì)胞凋亡作用主要通過其BIR區(qū)(位于Livin的86至154氨基酸處)與半胱氨酸蛋白水解酶(Caspases家族)結(jié)合，抑制其活性，與Caspases蛋白家族中的多個(gè)成員相互作用，尤其是Caspases3/-7和Caspases-9的活性，阻止Caspase蛋白在細(xì)胞凋亡時(shí)執(zhí)行蛋白切除功能，達(dá)到阻斷凋亡受體及以線粒體為基礎(chǔ)的凋亡途徑而起作用。Caspase-3是Caspase家族中最重要的凋亡執(zhí)行者之一，全部或部分負(fù)責(zé)大量底物的蛋白水解，抑制Caspase-3的活性或拮抗其功能可使細(xì)胞凋亡受抑，說明Caspase-3對細(xì)胞凋亡是必需的。本實(shí)驗(yàn)表明Livin蛋白在正常子宮頸鱗狀上皮、CIN和子宮頸鱗狀細(xì)胞癌3組中表達(dá)呈遞增趨勢，而 Caspase-3蛋白呈遞減趨勢。這說明 Livin和Caspase-3在宮頸鱗癌發(fā)生、發(fā)展中的起著重要作用。Livin與Caspase-3的宮頸鱗癌中表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，這證實(shí)Livin可通過對誘發(fā)凋亡的效應(yīng)性蛋白酶Caspase-3有直接抑制作用。在細(xì)胞中Livin蛋白將Caspase-3牢固地連接在中心粒上，而使Caspase-3無法發(fā)揮蛋白水解的催化功能。凋亡途徑因此失去重要的酶，而無法進(jìn)行凋亡酶依賴的凋亡。

本結(jié)果顯示，子宮頸鱗狀細(xì)胞癌中Livin陽性表達(dá)率明顯高于正常組(P＜0.05)，但正常宮頸組織無Livin蛋白表達(dá)。提示Livin可以作為宮頸癌的一種標(biāo)志物，這不僅有助于宮頸癌的診斷，而且可以為宮頸癌的生物治療提供依據(jù)。另外，Livin表達(dá)與腫瘤分化程度密切相關(guān)，隨宮頸癌分化程度降低，Livin表達(dá)率呈增高趨勢，有淋巴轉(zhuǎn)移者其陽性表達(dá)率高于無淋巴轉(zhuǎn)移，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);說明宮頸癌組織惡性分化程度與Livin的表達(dá)有關(guān);與PCNA的表達(dá)呈正相關(guān)(P＜0.05)，進(jìn)一步從側(cè)面說明了凋亡抑制基因Livin在抑制宮頸癌細(xì)胞凋亡及促進(jìn)增殖中的作用。Livin在一些腫瘤中的特異表達(dá)及其功能，為一些惡性腫瘤的檢測提供新的分子標(biāo)志物。亦成為抗腫瘤治療的新靶點(diǎn)，目前人們已經(jīng)能夠在基因水平上干預(yù)基因表達(dá)失調(diào)所致的疾病，特別以mRNA作為靶標(biāo)的反義藥物，可以減少和消除有害基因的表達(dá)，達(dá)到治療疾病的目的。因此，通過直接阻斷Livin與目的分子的結(jié)合，可以加速腫瘤細(xì)胞凋亡，為腫瘤治療提供新的途徑。這些預(yù)示著Livin可作為新腫瘤抗原來檢測這些腫瘤，并可能成為腫瘤治療上有前途的分子靶點(diǎn)。然而這些方法目前還僅僅停留在實(shí)驗(yàn)階段，而且大都是體外實(shí)驗(yàn)，還有待進(jìn)一步的臨床實(shí)驗(yàn)來證實(shí)，相信對Livin的進(jìn)一步研究能夠?yàn)槟[瘤的治療提供行之有效的新途徑。

1 WHO腫瘤病理與遺傳學(xué)分類，女性生殖器官腫瘤(2003).診斷病理學(xué)雜志社，2006.123-125.

2 回允中主譯，Stanley J主編.女性生殖道病理學(xué).第1版.北京:北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2005.209.

3 劉彤華主編.診斷病理學(xué).第1版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2006. 512.

4 Lin JH，Deng G，Huang Q，et al.KIAP，a navel member of the inhibitor of apoptosis protein family.Biochem Biophys Res Commun，2000，279:820-831.

5 Gzzaniga P，Gradilone A，Giuliani L，et al.Expression and prognostic significance of Livin，Survivin and other apoptosis related genes in the progression of superficial bladder cancer.Ann Oncol，2003，14:85-90.

6 Vucic D，Stennicke HR，Pisabarro MT，et al.ML-IAP，a novel inhibitor of apoptosis that is preferentially expressed in human melanomas.Curr Biol，2000，10:1359-1366.

7 Ka H，Hunt JS.Temporal and spatial patterns of expression of inhibitors of apoptosis in human placentas.Am J Pathol，2003，163:413-422.

8 Vucic D，Deshayes K，Ackerly H，et al.SMAC negatively regulates the Antiapoptotic activity ofmelanoma inhibitor of apoptosis(ML-IAP).J Biol Chem，2002，277:12275-12279.

9 Kasof GM，Gomes BC.Livin，a novel inhibitor of apoptosis protein family member.J Biol Chem，2001，276:3238-3246.