薯蕷皂苷對氧化低密度脂蛋白誘導血管內皮細胞凋亡的保護作用

蘇 健，郭衛莉，李 欣，康 毅，高衛真

（天津醫科大學藥理學教研室，天津 300070）

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是世界上最常見的心血管疾病。在AS的起始和發展過程中內皮細胞（EC）的功能障礙起著關鍵作用，被視為獨立的危險因素。氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL）在AS的發病因素中格外重要，因為其可以損傷EC[1-2]，降低EC的增殖和一氧化氮（NO）水平加速AS[3]。本研究采用牛胸主動脈內皮細胞的體外培養，以150μg/mL濃度Ox-LDL作用6h的條件下，建立血管EC損傷模型，應用薯蕷皂苷（Dioscin）進行預先給藥24h做預防性治療，研究薯蕷皂苷對Ox-LDL誘導血管內皮細胞凋亡的保護作用，探討薯蕷皂苷對Ox-LDL誘導血管內皮細胞凋亡的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 薯蕷皂苷粉：國家天然藥物研究中心提供，純度為98%；Ox-LDL：廣州奕源生物科技有限公司；低糖DMEM培養基：北京天潤善達生物科技有限責任公司；南美胎牛血清（FBS）：Hyclone公司；胰蛋白酶-EDTA：Gibco公司；MTT：中奧天元公司；NO測定試劑盒：南京建成生物工程研究所；牛內皮素酶聯免疫分析試劑盒：RD公司；Annexin V--FITC細胞凋亡測定試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、Western及IP細胞裂解液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、辣根過氧化物酶標記二抗、Tublin抗體：碧云天生物技術研究所；Tween-20：天津市化學試劑一廠；預染蛋白質Marker：Fermantas公司；發光底物試劑盒：博士德生物有限公司；牛血清白蛋白：美國Sigma公司；eNOS一抗：英國Abcam公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 牛主動脈內皮細胞（Bovine aortic endothelial cells，BAECs）的培養和鑒定 完整分離牛胸主動脈，用PBS沖洗移至托盤后進超凈臺，縱向剪開，用PBS沖洗后剪成2～3cm×2～3cm塊狀。在培養皿中滴加0.25%胰酶，內膜面朝下平鋪。37℃消化10～ 15min。加入含10%FBS的培養液終止。輕輕刮取，將EC種植于含20%FBS的完全培養液中，置于37℃，5%CO2培養箱中，24h后換液，細胞長至融合狀態后即可傳代。倒置相差顯微鏡下細胞呈扁平多角形，鋪路石狀。VIII因子相關抗原免疫組化染色為陽性，3～10代可用于實驗。

1.2.2 實驗分組 設5個實驗組：（1）對照組(control)：先用含10%FBS的完全培養液培養24h，再換用含5%FBS的完全培養液培養6h；（2）模型組：先用含10%FBS的完全培養液培養24h，再加入終濃度為150μg/mL的Ox-LDL培養6h；（3）薯蕷皂苷低、中、高濃度干預組（Dio L、M、H）：先分別用終濃度為4.8、12、30μg/mL的薯蕷皂苷培養24h，再換用終濃度為150μg/mL的Ox-LDL培養6h。

1.2.3 MTT法檢測細胞存活率 取各組培養的細胞，調整密度，種于96孔板，每孔加入0.5%MTT溶液10μL，4h后棄上清，每孔加入150μL DMSO，震蕩10min，490nm波長處檢測吸光度，細胞存活率（%）=OD檢測組/OD對照組×100%。

1.2.4 流式細胞術分析測定細胞凋亡率 收集每組刮取的細胞，重懸，離心1000×g，5min。棄上清，收集細胞，用PBS重懸并計數。取密度為5×104～1× 105個/mL重懸的細胞，離心1000×g，5min，棄上清，先加入195μL Annexin V-FITC結合液重懸，再加入5μL Annexin V-FITC，混勻。室溫避光孵育10min。離心1000×g，5min，棄上清，加入190μL Annexin V-FITC結合液重懸。加入10μL碘化丙啶染色液，混勻，冰浴避光放置。1h內上機進行檢測以Expo32軟件處理分析、計算凋亡率。

1.2.5 硝酸還原酶法測定NO濃度 取各組上清，按照NO測定試劑盒說明書操作，利用酶標儀比色法進行定量檢測。

1.2.6 雙抗體夾心法測定內皮素（ET）濃度 用無菌管收集各組細胞上清，按照牛內皮素酶聯免疫分析試劑盒說明書操作，利用酶標儀進行檢測。

1.2.7 Western Blot測定內皮細胞eNOS的蛋白表達 取培養的各組細胞，棄液后用PBS洗滌2～3遍。加入裂解液（6孔板每孔100μL）后置于冰上10～20min。刮下細胞，收集在EP管中。12000×g離心，4℃，2min。吸取上清液（目的蛋白）并將其轉移至新EP管中，BCA法進行定量。取蛋白質樣品并與1/4體積的5×上樣緩沖液充分混勻，100℃煮沸5～10min，離心，靜置。用電泳緩沖液清洗加樣孔，按順序加樣，將與上樣緩沖液混勻的樣本蛋白按每孔30μg加入。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，分離的蛋白用電轉移法轉到PVDF膜，5%脫脂牛奶中室溫搖動1.5h封閉，加入以1∶1000稀釋的一抗，4℃過夜。再加入TBST稀釋的辣根過氧化物酶標記二抗，室溫搖動孵育1.5h，顯色，曝光。觀察結果并掃描，采用Image J軟件對條帶進行灰度值分析，以eNOS蛋白與內參照Tublin灰度比值代表eNOS蛋白表達水平。

2 結果

2.1 MTT法檢測細胞存活率 與對照組比較，模型組存活率降至68.49%，比對照組有顯著性降低（P< 0.01）；薯蕷皂苷低中高濃度組存活率比模型組明顯升高（P<0.01；P<0.01；P<0.05），損傷明顯減輕，且3個藥物組之間兩兩比較均有統計學差異（P<0.05）。見表1。

表1 薯蕷皂苷對Ox-LDL誘導的BAECs存活率的影響(±s,n=6)Tab 1 Effect of dioscin on BAECs proliferation induced by Ox-LDL (±s,n=6)

表1 薯蕷皂苷對Ox-LDL誘導的BAECs存活率的影響(±s,n=6)Tab 1 Effect of dioscin on BAECs proliferation induced by Ox-LDL (±s,n=6)

與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較#P＜0.05，##P＜0.01

4.81230組別Control Ox-LDL Dio L Dio M Dio H濃度/(μg/mL) 00OD值0.565±0.0610.387±0.0100.412±0.0140.474±0.0230.521±0.038存活率/% 100±064.89±1.02** 72.92±5.24*# 83.89±4.31*## 92.21±6.78##

2.2 流式細胞術分析測定細胞凋亡率 結果顯示，在正常培養時EC發生少量凋亡，模型組細胞凋亡率增加（P<0.01）；3個不同濃度薯蕷皂苷干預組凋亡率較模型組降低（P<0.01；P<0.01；P<0.05），且呈濃度依賴性。表明不同濃度薯蕷皂苷均能抑制Ox-LDL誘導的EC凋亡。見表2。

2.3 硝酸還原酶法測定NO濃度 與對照組相比，模型組的NO濃度顯著降低（P<0.01）。薯蕷皂苷低、中、高3個濃度進行干預后，與模型組相比，NO濃度升高（P<0.01；P<0.01；P<0.05），且3個濃度之間具有統計學差異。見表2。

2.4 雙抗體夾心法測定ET濃度 與對照組相比，模型組的ET濃度升高（P<0.05）。薯蕷皂苷低、中、高3個濃度進行干預后，與模型組相比，ET濃度降低（P<0.05；P<0.05；P<0.05），且3個濃度之間具有統計學差異。見表2。

表2 薯蕷皂苷對Ox-LDL誘導的BAECs凋亡率，NO濃度和ET濃度的影響(±s,n=6)Tab 2 Effect of dioscin on apoptosis rate,NO concentration and ET concentration in BAECs induced by Ox-LDL(±s,n=6)

表2 薯蕷皂苷對Ox-LDL誘導的BAECs凋亡率，NO濃度和ET濃度的影響(±s,n=6)Tab 2 Effect of dioscin on apoptosis rate,NO concentration and ET concentration in BAECs induced by Ox-LDL(±s,n=6)

與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較#P＜0.05，##P＜0.01

ET/(μg/L) 16.93±1.6425.89±2.07* 23.92±1.05*# 21.30±1.42*# 17.74±1.58#組別Control Ox-LDL Dio L Dio M Dio H濃度/(μg/mL) 004.81230凋亡率/% 30.0±3.2749.6±10.44** 46.7±10.76**# 36.5±8.29*# 30.4±4.38## NO/(μmol/L) 59.46±16.1927.03±3.12** 29.05±5.99**# 38.94±6.34*# 49.19±19.24*##

2.5 Western Blot測定eNOS蛋白表達 Western Blot檢測結果顯示，對照組有一定量的eNOS蛋白表達，Ox-LDL誘導使EC的eNOS蛋白表達明顯降低，條帶強度明顯減弱（P<0.01）；加入不同濃度薯蕷皂苷預干預后，eNOS蛋白表達明顯增強，條帶強度恢復，并呈一定的劑量依賴性（P<0.05）。見圖1。

3 討論

AS是一種由血脂代謝障礙、內皮功能障礙和持續炎癥等觸發的慢性致病過程[4]，是危害人類健康的主要疾病之一。對于AS發病機制的研究一直是心血管疾病研究的熱點。內皮細胞的凋亡可能對動脈粥樣硬化脂質斑塊的侵蝕與破裂起著重要作用，而Ox-LDL是引起內皮細胞凋亡和壞死的關鍵因素。

Ox-LDL無論是通過結合并激活其血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體-1（LOX-1），還是通過直接的細胞毒作用，皆可抑制內皮源性血管舒張因子NO的生成，并促進血管收縮因子ET的合成和釋放。Ox-LDL能損傷血管內合成和釋放NO的功能，其機制可能涉及一氧化氮合酶(NOS)的基因調控和活性調節，也可能僅僅是LDL氧化過程中生成的超氧陰離子對細胞外NO的滅活增加所致，從而抑制NO合成。Ox-LDL還能促進血栓形成[5]，同時Ox-LDL作用于內皮，可導致局部血液凝固機制紊亂，引發纖維蛋白在血管壁沉積，這是AS發生發展中的重要環節。此外，Ox-LDL可以通過誘導內皮表面形成血管細胞黏附分子(VCAM-1)和細胞間黏附分子-1（ICAM-1）[6]及影響AS斑塊穩定性等因素導致內皮細胞損傷。本研究采用Ox-LDL作為誘導劑，制備血管內皮細胞的損傷模型，這和機體AS的病理損傷十分接近。研究顯示，牛胸主動脈內皮細胞對Ox-LDL誘導的細胞存活率降低具有濃度和時間依賴性，與文獻報道一致[7]。

現代藥理研究表明，薯蕷皂苷具有明顯的心血管作用，作用機制包括穩定心肌細胞搏動頻率、降低線粒體膜電位、減輕鈣超載[8]、改善能量代謝[9]。本研究發現不同濃度的薯蕷皂苷均能顯著提高Ox-LDL誘導損傷的EC存活率，使ET合成與分泌減少，NO合成與分泌增加，從而提高eNOS的表達。冠心病死者的冠狀動脈組織以及活體冠狀動脈組織的研究均表明，在粥樣斑塊表面覆蓋的內皮細胞內，eNOS表達均降低[10]。還有研究表明，對AS家兔進行eNOS轉基因處理，7d后AS病變消退[1]。同樣在AS動物模型中，注入eNOS抑制劑或是通過eNOS基因敲除，均能抑制NO的形成，促進AS發生[12]。但其深入的作用機制還有待于進一步地研究探討，如薯蕷皂苷如何激活eNOS。

綜上所述，本研究證實了Ox-LDL對EC增殖有較強的抑制作用，呈現濃度和時間依賴性，薯蕷皂苷對Ox-LDL誘導的EC凋亡具有重要保護作用，且呈濃度依賴性。這一研究結果為進一步研究薯蕷皂苷在AS治療方面提供了一定的理論基礎，對心血管疾病的預防、治療及預后有著積極的意義。

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