側(cè)腦室注射氯胺酮降低成年SD大鼠海馬區(qū)突觸可塑性

郭東勇，譚 濤，田 心，王國林

（1.天津醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科，天津市腫瘤防治重點實驗室，天津300060；2.天津醫(yī)科大學生物醫(yī)學工程學院，天津300070；3.天津醫(yī)科大學總醫(yī)院麻醉科，天津300052）

氯胺酮（ketamine）屬苯環(huán)已哌啶（PCP）類全身麻醉藥,在臨床麻醉中廣泛應用。它既可顯著抑制神經(jīng)元煙堿受體功能，同時又是NMDA受體的非特異性阻斷劑，這兩種受體對突觸可塑性長時程增強（long-term potentiation，LTP）的產(chǎn)生、維持和學習記憶功能至關重要[1],因此氯胺酮對學習記憶功能的影響作用越來越引起人們的關注。本實驗即是對成年SD大鼠側(cè)腦室注射氯胺酮，從電生理角度評估其對與學習記憶相關的突觸可塑性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級成年SD大鼠12只，雌雄各半，由天津市放射所動物實驗中心提供。大鼠在12h/12h明/暗交替、室溫（23±2）℃、濕度（50±10）%的環(huán)境中喂養(yǎng)。

1.2 實驗設計 雌雄鼠分別隨機分為實驗組（C-I組）和對照組（C組）。兩組動物均應用20%烏拉坦腹腔注射（1.5g·kg-1）麻醉后，頭部固定于大鼠立體定位儀（SN-2Narishige,Japan）。實驗組經(jīng)右側(cè)腦室注射50μg氯胺酮（批號100818，福建古田藥業(yè)有限公司，生理鹽水稀釋至5μL）；對照組經(jīng)右側(cè)腦室注射5μL生理鹽水。刺激電極為自制特氟隆不銹鋼雙極電極(尖端直徑300μm，兩尖端相距約0.5mm)置于大鼠內(nèi)嗅區(qū)前穿通纖維（perforant path,PP）（AP：7.5mm，L/R：4.4mm，H：3.4～4.0mm）[2]；記錄電極是經(jīng)電極拉制儀(P-95Heka,Germany)拉制成的尖端3～5μm、內(nèi)灌2mol·L-1NaCl的玻璃電極，置于海馬DG（AP：3.7mm，L/R：2.5mm，H：3.4～3.6mm）。刺激信號從刺激器（Master-8A.M.P.I，Israel）輸出，經(jīng)隔離器（ISO-Flex A.M.P.I,Israel）到達刺激電極，記錄電極記錄細胞外場興奮性突觸后電位（field excitatory postsynaptic potential,fEPSP）及突觸后群峰電位（postsynaptic population spike，PPS），并輸入膜片鉗放大器（Axon-2B Axon,America），經(jīng)數(shù)模轉(zhuǎn)換器（Digidata 132x digitizer Axon,America）輸入數(shù)據(jù)采集軟件（Clampex 9.0Axon,America）采集并存儲于計算機中。實驗過程中，應用恒溫系統(tǒng)維持動物體溫（37±1）℃。

1.3 側(cè)腦室注射氯胺酮 頭頂部去毛，常規(guī)消毒皮膚，頭頂部正中切口，沿顱頂中線剪開皮膚，暴露頭骨及前囟，依據(jù)George Paxions&Charles Watson大鼠腦立體定位圖譜，于前囟（AP）后0.8mm，中線右側(cè)（MR）旁開1.5mm，用牙科鉆鉆開顱骨，微量注射器自腦表面垂直進針硬腦膜下（DV）4.0mm（AP：-0.8mm，MR：1.5mm，DV：4.0mm），于右側(cè)腦室內(nèi)緩慢注射50μg氯胺酮（生理鹽水稀釋至5μL）留針5min后慢慢退出。

1.4 LTP記錄 正常組大鼠雙側(cè)海馬均進行LTP實驗。條件刺激（conditioned stimulus,CS）為波寬150μs、頻率0.5Hz的恒流方波。改變刺激強度（0.15～1.0mA），測定輸入/輸出（Input/Output,I/O）曲線。選擇誘發(fā)50%最大群峰電位（population spike, PS）幅值的刺激強度為CS強度。PS穩(wěn)定（幅值變化小于10%）20min后，CS刺激并記錄30min，作為基線，后行高頻刺激（high frequency stimulus,HFS）（20個200Hz的脈沖為一組，間隔2s，共10組，強度為誘發(fā)75%最大PS幅值的刺激強度）。HFS后，改用CS并記錄60min，觀察并計算PS幅值改變情況[3]。氯胺酮組進行LTP實驗時，記錄基線穩(wěn)定30min后，緩慢注射50μg氯胺酮（生理鹽水稀釋至5μL）留針5min后慢慢退出，然后重新記錄基線30min后，再給高頻刺激。

1.5 統(tǒng)計學分析 PS幅值用第一個下降相最低點到兩個上升波峰連線中點距離來度量（圖1）。LTP改變程度用刺激后與刺激前PS幅值百分比來反映。數(shù)據(jù)以±s表示。組間差異使用SPSS15.0經(jīng)t檢驗進行分析，P<0.05表示在統(tǒng)計學上有顯著性差異。

圖1 在體大鼠海馬PP-DG通路誘發(fā)的場電位及其測量示意圖Fig 1 EPSP induced in rat hippocampal region PP-DG and measurement method of PS amplitude

2 結(jié)果

刺激大鼠海馬PP，細胞外記錄海馬DG區(qū)PS。LTP中突觸可塑性改變程度用HFS后PS幅值與條件刺激PS幅值均值之比表示。HFS后C組、C-I組PS幅值均增加且穩(wěn)定，通常能持續(xù)1h以上。高頻刺激后，C組PS幅值維持在較高水平：刺激后30min時為條件刺激PS幅值的（216.29±12.11）%（n=8），刺激后60min時為（202.33±11.53）%（n=8）；C-I組PS幅值在高頻刺激后前5min較高，后隨著時間增加有大幅減小，刺激后30min時為條件刺激PS幅值的（138.04±6.50）%（n=9），刺激后 60min時為（149.60±10.86）%（n=9），氯胺酮麻醉組LTP突觸可塑性改變程度較對照組顯著降低（P<0.05）（圖2A、2B）。

圖2 側(cè)腦室注射氯胺酮降低成年大鼠海馬區(qū)LTPFig 2 Ketamine of intracerebroventricular injection to adult SD rats reduces synaptic plasticity of hippocampus

3 討論

氯胺酮是臨床中最常用于嬰幼兒的麻醉藥，是NMDA受體拮抗劑，它作用于NMDA受體的PCP結(jié)合位點，縮短了NMDA受體通道的開放時間，減少了通道開放的頻率，從而阻礙突觸的興奮性傳遞[4]。NMDA受體廣泛分布于海馬，對LTP效應的產(chǎn)生和維持有著重要的作用[5]。因而，氯胺酮可通過NMDA受體阻斷各種刺激后產(chǎn)生的LTP效應，從而影響機體學習記憶能力[6]。

在體海馬場電位記錄可以完整保留海馬內(nèi)部以及海馬與周圍組織的所有神經(jīng)聯(lián)系，因而更能全面地反映海馬的突觸活動以及藥物作用的真實效能，因此，在體海馬場電位以及LTP記錄更加受到重視，較離體腦片記錄具有不可替代的生理學意義。而側(cè)腦室注射氯胺酮可直接、快捷地非競爭性拮抗腦內(nèi)NMDA受體，達到快速觀察突觸傳遞的變化及研究相關影響因素。這兩種方法相結(jié)合的研究在很多文獻中被應用。本實驗結(jié)果顯示，成年大鼠側(cè)腦室注射氯胺酮后短時間內(nèi)即可顯著降低海馬區(qū)LTP水平，說明側(cè)腦室注射氯胺酮可迅速抑制海馬區(qū)神經(jīng)元的突觸傳遞可塑性。杜鵑等[7]對成年大鼠側(cè)腦室注射氯胺酮，與生理鹽水組對比注藥5d后對學習與記憶的影響，發(fā)現(xiàn)大鼠在Morris水迷宮中,學習能力與對照組相比顯著下降，結(jié)果表明側(cè)腦室注射氯胺酮可明顯抑制大鼠的學習能力。

正常大鼠在體LTP記錄的誘發(fā)，主要是考察立體定位儀下大鼠海馬記錄區(qū)域的定位準確與否，以及LTP記錄相關儀器的誘發(fā)成功率情況。立體定位儀在側(cè)腦室注射氯胺酮和海馬區(qū)LTP記錄中是關鍵儀器，整體動物的核團定位主要靠立體定位儀從三維結(jié)構(gòu)插入到指定位置。實驗過程中，每只大鼠都是雙側(cè)海馬定位及LTP誘發(fā)及記錄，但不是每側(cè)海馬都能成功記錄到穩(wěn)定而持久的LTP波形的。而實驗中應用恒溫控制系統(tǒng)，是為保證急性實驗時動物的體溫維持在正常范圍內(nèi)，實驗結(jié)果不至于因體溫變化而造成明顯誤差。

本實驗得出側(cè)腦室注射氯胺酮降低大鼠神經(jīng)系統(tǒng)突觸可塑性，進而影響大鼠的學習記憶功能也得到相關文獻的證實，但是發(fā)生機制的研究還不明確，也已成為近期研究的熱門。

［1］ Lu Y,Christian K,Lu B.BDNF:A key regulator for protein synthe sis dependent LTP and longtermmemory[J].Neurobiol Learn Mem, 2008,89（3）:312

［2］ Abe K,Fujimoto T,Akaishi T,et al.Basolateral amygdala D1-and D2-dopaminergic system promotes the formation of long-term po tentiation in thedentategyrusofanesthetized rats[J].ProgNeuropsychopharmacol Biol Psychiatry,2009,33（3）:552

［3］ 譚濤,張保良,田心.寡聚體Aβ1-42對大鼠海馬突觸可塑性的慢性影響[J].生理學報,2011,63（3）:225

［4］ BhuttaAT.Ketamine:acontroversialdrugforneonates[J].SeminPerinatol,2007,31（5）:303

［5］ Kozek-Langenecker S A,Marhofer P,Sator-Katzenschlager S M,et al.S(+)-ketamine for long-termsedation in a child with retinoblastoma undergoinginterstitial brachytherapy[J].Pediatr Anesth,2005, 15（3）:248

［6］ Morgan C J,Riccelli M,Maitland C H,et al.Long-term effects of ketamine:evidence for a persisting impairment of source memory in recreational users[J].DrugAlcohol Depend,2004,75（3）:301

［7］ 杜鵑,王紅偉.側(cè)腦室注射氯胺酮對大鼠學習能力的影響[J].醫(yī)藥論壇雜志，2009，30（23）:12