大黃素對(duì)腸上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

丁博文，嵇 武，白小武，車(chē)金輝，張 強(qiáng)，李秋榮

腸黏膜屏障包括機(jī)械屏障、免疫屏障、微生物屏障和化學(xué)屏障，機(jī)械屏障是腸黏膜屏障的基礎(chǔ)和最重要的部分［1］。緊密連接形成的連續(xù)環(huán)周上皮細(xì)胞間連接，是構(gòu)成腸黏膜機(jī)械屏障最重要的結(jié)構(gòu)［2］。大黃素是中藥大黃的重要單體，具有多種功效，如抑菌、抗炎、改善微循環(huán)、抗癌等，具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值［3］，近來(lái)有研究證實(shí)大黃素對(duì)腸黏膜屏障具有一定的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立腸上皮細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)模型，研究大黃素對(duì)緊密連接蛋白的影響，探討大黃素保護(hù)腸黏膜屏障的內(nèi)在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 腸上皮細(xì)胞株Caco-2 細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所)、大黃素(江蘇食品藥品檢定所，純度＞99.9%)、Mllicell 插入式培養(yǎng)皿(Millipore 公司)、兔抗鼠多克隆緊密連接蛋白Occludin 和ZO-1 抗體(Santa Cruz 公司)、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)-羊抗兔二抗(Sigma 公司)、RT-PCR 試劑盒(北京全式金生物公司)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物(北京全式金生物公司)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器 紫外分光光度計(jì)(Beckman Coulter)、JEM-1010 透射電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社)、MillicellTM 電阻測(cè)定系統(tǒng)(Millipore 公司)。

1.3 Caco-2 細(xì)胞的培養(yǎng) Caco-2 細(xì)胞在37℃、5%CO2和90%相對(duì)濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 ～3 d換液一次，每5 d 按1:3 的比例傳代。Caco-2 細(xì)胞接種于6 孔培養(yǎng)板內(nèi)，供Western-blot 及RT-PCR 分析;接種于Millicell 聚碳酸酯膜(4.5cm2，0.4 μm)，供跨上皮電阻值(transepithelial electrical resistance，TEER)的檢測(cè)及透射電鏡分析。

1.4 Caco-2 細(xì)胞H/R 損傷模型的建立方法 取生長(zhǎng)達(dá)到80%～90%融合的Caco-2 細(xì)胞，隨機(jī)分為四組:正常細(xì)胞(N)組、H/R 組、缺氧復(fù)氧+Hanks 平衡鹽溶液(H/R+HBSS)組、缺氧復(fù)氧+大黃素(H/R+EN)組。H/R+EN 組細(xì)胞在H/R 前30 min 用10 μmol/L 大黃素處理。將細(xì)胞置入密閉容器中，通入95%N2、5%CO2的混合氣體后將容器置于培養(yǎng)箱中孵育90 min(缺氧)，取出，置入培養(yǎng)箱中孵育2 h(復(fù)氧)。

1.5 TEER 值的檢測(cè) 用MillicellTM 電阻測(cè)定系統(tǒng)測(cè)定Caco-2 細(xì)胞單層的TEER 值。TEER 是反映腸黏膜屏障通透性的主要指標(biāo)之一，與細(xì)胞單層的通透性在一定范圍內(nèi)呈負(fù)相關(guān)。

1.6 透射電鏡觀察細(xì)胞間緊密連接的變化 將Millicell 聚碳酸酯膜剪下，依次經(jīng)固定、脫水、包埋、修塊、切片，用醋酸鈾、硝酸鉛雙重染色，透射電鏡照相。

1.7 Western blot 檢測(cè) 將刮取得到的Caco-2 細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液提取蛋白，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。取樣品蛋白40 μg，以聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳分離蛋白質(zhì)，濕轉(zhuǎn)移法將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。加入兔抗鼠Occludin、ZO-1 一抗(1:500 稀釋)，4℃下孵育過(guò)夜，加入羊抗兔HRP-IgG 抗體(1:3000 稀釋)，室溫孵育1 h，ECL 法顯色。相應(yīng)蛋白表達(dá)值為條帶的灰度值除以β-actin 灰度值。

1.8 RT-PCR 檢測(cè) 按照Trizol 說(shuō)明書(shū)方法提取Caco-2 細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)量計(jì)算RNA純度和濃度。在20μl 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，以2.0μg的mRNA 為模板將mRNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR 反應(yīng)以GAPDH 為內(nèi)參，使用Primer5.0 軟件設(shè)計(jì)引物序列(表1)。反應(yīng)條件:95℃5 min，95℃5 s，62℃15 s，72℃1 min。PCR 擴(kuò)增循環(huán)35 次。PCR 反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，數(shù)字成像儀照相分析，結(jié)果以O(shè)ccludin/GAPDH、ZO-1/GAPDH 的整合光密度值(integrated density value，IDV)的比值表示。

表1 RT-PCR 引物序列及長(zhǎng)度

2 結(jié) 果

2.1 TEER 值的檢測(cè) 與N 組比較，H/R、H/R+HBSS 和H/R+EN 三組TEER 值顯著降低(P ＜0.05);H/R、H/R+HBSS 兩組TEER 值明顯低于H/R+EN 組(P ＜0.05);H/R、H/R+HBSS 兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05，表2)。

表2 各組Caco-2 細(xì)胞TEER 值檢測(cè)結(jié)果)

表2 各組Caco-2 細(xì)胞TEER 值檢測(cè)結(jié)果)

注:與N 組比較，*P ＜0.05;與H/R+EN 組比較，#P ＜0.05

組別 n 檢測(cè)結(jié)果(%初始TEER)N 組12 100.38±4.28 H/R+EN 組 12 46.83±11.83*H/R 組 12 24.50±9.19*#H/R+HBSS 組 12 25.25±8.11*#

2.2 透射電鏡檢測(cè)緊密連接 N 組緊密連接完整清晰;H/R+EN 組緊密連接可見(jiàn)腫脹，但結(jié)構(gòu)仍比較清晰;H/R、H/R+HBSS 組緊密連接結(jié)構(gòu)腫脹模糊，破壞明顯(圖1)。

2.3 Western blot 檢測(cè)Occludin 和ZO-1 蛋白的表達(dá) 與N 組相比，H/R+EN、H/R、H/R+HBSS三組Occludin 和ZO-1 蛋白表達(dá)水平明顯降低(P ＜0.05);H/R、H/R+HBSS 兩組的ZO-1 和Occludin蛋白表達(dá)水平顯著低于H/R+EN 組(P ＜0.05);H/R、H/R+HBSS 兩組間差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05，圖2、表3)。

圖1 Caco-2 細(xì)胞的透射電鏡變化(醋酸鈾、硝酸鉛雙重染色 ×25 000)

圖2 各組Caco-2 細(xì)胞中Occludin、ZO-1 蛋白的表達(dá)

表3 各組Caco-2 細(xì)胞中Occludin、ZO-1 蛋白的相對(duì)表達(dá)(%)

表3 各組Caco-2 細(xì)胞中Occludin、ZO-1 蛋白的相對(duì)表達(dá)(%)

注:與N 組比較，*P ＜0.05;與H/R+EN 組比較，#P ＜0.05

組別 n Occludin 蛋白 ZO-1蛋白N 組6 100±14.73 100±9.56 H/R+EN 組 6 64.35±7.10* 57.45±8.17*H/R 組 6 38.30±4.20*# 29.51±6.39*#H/R+HBSS 組 6 34.37±4.82*# 32.49±5.81*#

2.4 RT-PCR 檢測(cè)Occludin 和ZO-1 的mRNA 表達(dá)

相對(duì)于N 組，H/R+EN、H/R、H/R+HBSS 三組ZO-1 和Occludin 的mRNA 表達(dá)水平明顯下調(diào)(P ＜0.05);H/R、H/R+HBSS 兩組的ZO-1 和Occludin的mRNA 表達(dá)水平顯著低于H/R+EN 組(P ＜0.05);H/R、H/R+HBSS 兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05，圖3、表4)。

圖3 各組Caco-2 細(xì)胞中ZO-1、Occludin mRNA 的表達(dá)

表4 各組Caco-2 細(xì)胞中ZO-1、Occludin mRNA 的表達(dá)()

表4 各組Caco-2 細(xì)胞中ZO-1、Occludin mRNA 的表達(dá)()

注:與N 組比較，*P ＜0.05;與H/R+EN 組比較，#P ＜0.05

組別 n Occludin mRNA ZO-1mRNA N 組6 0.808±0.117 0.952±0.101 H/R+EN 組 6 0.648±0.061* 0.752±0.031*H/R 組 6 0.431±0.014# 0.535±0.016*#H/R+HBSS 組 6 0.464±0.025*# 0.484±0.051*#

3 討 論

腸黏膜屏障具有防止腸道內(nèi)病原微生物及毒素由腸腔侵入腸外器官的作用，以機(jī)械屏障最為重要，其基礎(chǔ)為單層上皮細(xì)胞和細(xì)胞間的緊密連接［4］。ZO-1、Occludin 是構(gòu)成緊密連接的兩種重要組成部分［5］。ZO-1 與ZO-2 形成穩(wěn)定的復(fù)合體，直接結(jié)合Occludin 蛋白，形成一個(gè)網(wǎng)絡(luò)支架，將Occludin 和肌動(dòng)蛋白系統(tǒng)連接在一起形成穩(wěn)定的連接系統(tǒng)，在信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中起轉(zhuǎn)化作用，從而控制細(xì)胞周?chē)琳希?］。

腸黏膜屏障功能的損害是一復(fù)雜的過(guò)程，諸多因素可能參與了這一過(guò)程的調(diào)控。目前的治療有給予腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)支持等［7］，但其具體的作用機(jī)制未完全闡明。大黃素曾長(zhǎng)期作為導(dǎo)瀉、抗炎藥使用。許多研究證實(shí)大黃素可以顯著降低腫瘤壞死因子(TNFα)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)的表達(dá)水平以及過(guò)氧化物酶(MPO)的活性［8-9］。大黃素具有的潛在細(xì)胞因子抑制作用是由于它抑制了核因子(NF-κB)的活性。大黃素還具有清除氧自由基抗氧化作用，增加超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化酶的活性，減少丙二醛含量等［10］。

本研究通過(guò)體外培養(yǎng)腸上皮細(xì)胞株Caco-2 細(xì)胞制作H/R 模型模擬腸缺血/再灌注(I/R)損傷。腸缺血時(shí)，腸系膜血管處于低灌注狀態(tài)，導(dǎo)致腸絨毛上皮細(xì)胞壞死脫落，腸黏膜屏障功能受損、腸通透性增加;再灌注后，產(chǎn)生大量氧自由基，造成組織細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)一步削弱腸屏障功能［11］。H/R 損傷后Western blot 和RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，Caco-2細(xì)胞Occludin、ZO-1 蛋白的表達(dá)量和mRNA 的表達(dá)水平均明顯下降。ZO-1 蛋白表達(dá)減少會(huì)引起Occludin 等跨膜蛋白從細(xì)胞骨架上解離，Occludin 蛋白表達(dá)減少可使其封閉細(xì)胞旁縫隙的能力缺失，引起緊密連接開(kāi)放［12］。透射電鏡下觀察到Caco-2 細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)破壞明顯，TEER 值顯著下降，Caco-2 單層細(xì)胞通透性大幅上升進(jìn)一步證實(shí)腸黏膜屏障的完整性受到嚴(yán)重破壞，屏障功能下降。大黃素處理組Occludin、ZO-1 的蛋白表達(dá)量和mRNA 的表達(dá)水平明顯上升，表明大黃素對(duì)緊密連接結(jié)構(gòu)蛋白在蛋白表達(dá)水平和基因轉(zhuǎn)錄水平都具有顯著的保護(hù)作用。電鏡觀察也顯示細(xì)胞間緊密連結(jié)構(gòu)的破壞減輕，TEER 值升高，證實(shí)大黃素可以有效抑制Caco-2單層細(xì)胞通透性增加，保護(hù)腸上皮細(xì)胞的屏障功能。

因此，我們推測(cè)大黃素對(duì)腸黏膜屏障功能的保護(hù)作用可能是通過(guò)減少緊密連接結(jié)構(gòu)蛋白Occludin、ZO-1 的破壞，增加其表達(dá)，維持腸黏膜屏障的完整性來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本研究對(duì)于大黃素對(duì)腸黏膜屏障損傷的治療提供了部分理論依據(jù)，提示大黃素在治療消化系統(tǒng)疾病中具有很大潛力。

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