惠東地區產ESBLs大腸埃希菌中TEM型β-內酰胺酶臨床研究

周世娟 鐘惠香 陳錦順 呂福應 郭國才 黎敦鎮

廣東省惠東縣中醫院檢驗科，廣東惠東 516300

流行病學研究表明，當今世界范圍內，由質粒所介導的產超廣譜β-內酰胺酶（extended spectrum beta lactamases，ESBLs）是細菌耐藥的主要機制之一[1-2]。產ESBLs陰性桿菌多見于大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌等。近幾十年來，隨著廣譜抗菌藥物的廣泛使用，產ESBLs的大腸埃希菌已成為目前院內感染最常見的耐藥菌之一[3-4]。廣泛耐藥的大腸埃希菌給疾病治療帶來了嚴重的挑戰，嚴重影響著醫療質量，同時還增加了患者的經濟支出，因此，明確產ESBLs大腸埃希菌的耐藥機制、研制新的治療靶點以及減少細菌耐藥率成為現階段的研究熱點之一[5]。本研究擬收集筆者所在醫院產ESBLs大腸埃希菌，分析其主要耐藥率和基因突變情況，并通過分子生物學方法明確基因堿基突變的主要類型，為今后進一步研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 產ESBLs大腸埃希菌標本的來源

標本收集時間為2012年1 ～ 5月，標本來源主要為惠東縣中醫院臨床科室，包括：血、尿、痰、大便、穿刺液、分泌物、膽汁中分離的純培養菌株。采用法國Biomerieux公司的API鑒定試劑條（API 20E）進行鑒定，并用產ESBLs表型確證實驗篩選出產ESBLs大腸埃希菌86株：按CLSI文件M100-S20（2010年版）判斷標準：頭孢他啶和頭孢噻肟中任何一種藥物，加克拉維酸與相應不加克拉維酸后抑菌環直徑相比，增大5 mm及以上時判斷為ESBLs陽性。

1.2 抗菌藥物的使用

本研究所采用的藥物如下：頭孢拉定（CRD，杭州賽諾菲萬安特民生制藥有限公司， H33022275）、氨芐西林（AMP，廣州白云山制藥股份有限公司，H20043038）、頭孢呋辛（CXM，葛蘭素史克公司，H20030365）、頭孢他啶（CAZ，葛蘭素史克公司，J20030063）、頭孢哌酮/舒巴坦（SPR，輝瑞制藥有限公司，H20020597）、氨曲南（ATM，中美上海施貴寶制藥有限公司，H10970024）、亞胺培南/西司他?。═N，默沙東制藥有限公司，J20080046）、美羅培南[MP，住友制藥（蘇州）有限公司，J20100045]、左氧氟沙星[LFX，第一三共制藥（北京）有限公司，H20000655]、阿米卡星（AMK，蘇州一藥有限公司，H20090327）。

1.3 熒光定量PCR反應

所有標本均送中山大學達安基因公司進行檢測，采用熒光定量PCR法檢測大腸埃希菌TEM型β-內酰胺酶基因，PCR試劑盒由中山大學達安基因公司提供。

Forward Primer（正向引物）：5’-GGCTGGTTAACGACGTTACGACT-3’，Reverse Primer（反向引物）： 5’-AAACGTTCAGGACGGGCTA-3’。肺炎克雷伯菌ATCC700603為陽性對照，大腸埃希菌ATCC25922為陰性對照。

儀器：ABI 7500全自動熒光定量PCR儀，ABI 9700 PCR儀，ABI 3900臺式高通量DNA合成儀，科大創新HC-3018R高速冷凍離心機。

1.4 藥敏試驗分析

本研究采用瓊脂稀釋法測定藥物最低抑菌濃度（minimal inhibition concentration，MIC），方法和藥敏判斷標準按照CLSI文件M100-S20（2010年版）規定。β-內酰胺酶類抗菌藥物測定采用MIC法；非β-內酰胺酶類抗菌藥物則采用臨界濃度法測定藥物敏感性。培養基為Mueller-Hintom瓊脂（OXOID，Basingstoke，UK）。質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

1.5 DNA序列測定及分析

用ABI 377全自動測序儀對TEM酶全編碼基因的PCR擴增產物分別進行序列分析，測序結果在PUBMED Genebank在線比較基因序列。

2 結果

2.1 產ESBLs大腸埃希菌基因型

本課題所收集并分離的86株產ESBLs大腸埃希菌，其中TEM基因型49株（57.0%），SHV基因型16株（18.6%），CTX-M基因型21株（24.4%）；TEM分型主要有TEM-1、TEM-2、TEM-105、TEM-116和TEM-128，其中TEM-1和TEM-2型例數最多，分別為19例和17例。

2.2 產ESBLs大腸埃希菌耐藥性分析

由表1可見，醫院產ESBLs大腸埃希菌TEM型耐藥發生率較高；除亞胺培南/西司他丁和美羅培南敏感外，所有基因亞型細菌對β-內酰胺酶類和非β-內酰胺酶類抗菌藥物均耐藥。

2.3 產ESBLs大腸埃希菌TEM基因堿基突變類型

由表2可見，產ESBLs大腸埃希菌TEM基因堿基突變類型包括缺失、堿基置換、移碼和插入，其中缺失發生率最高，其次為堿基置換，而移碼突變和插入突變較少。

表1 產ESBLs大腸埃希菌TEM分型及耐藥性

表2 產ESBLs大腸埃希菌TEM基因突變類型

3 討論

本研究結果表明，目前惠東地區產ESBLs大腸埃希菌基因類型主要為TEM、SHV和CTX-M 三種類型，其中TEM基因型最常見，約占57.0%，而SHV和CTX-M基因型分別為18.6%和24.4%。TEM基因型中TEM-1和TEM-2所占例數最多，分別為18例和17例?；蚍治鼋Y果表明，產ESBLs大腸埃希菌TEM基因突變類型主要為缺失和堿基置換。藥敏實驗結果提示，除亞胺培南/西司他丁和美羅培南敏感外，所有TEM基因亞型細菌對β-內酰胺酶類和非β-內酰胺酶類抗菌藥物均耐藥。

近年來，大量臨床研究結果表明，產ESBLs大腸埃希菌耐藥率呈逐年上升的趨勢，且逐漸成為院內感染的頭號致病菌[6]。不同基因亞型ESBLs對藥物的敏感性和耐藥率存在較大的差異，導致臨床工作中時常出現同種細菌對同種抗菌藥物表現出不同耐藥性的現象[7]，嚴重影響著抗菌藥物的選擇，因此，探討某一地區主要致病菌耐藥發生率、抗菌藥物敏感性、耐藥基因類型以及主要堿基突變類型對指導抗菌藥物的選擇、改善醫療質量具有重要的臨床價值和社會意義。

ESBLs主要包括TEM、SHV、CTX-M和OXA四種類型[7-8]。其中SHV和OXA為TEM的主要衍生物。既往研究報道TEM型ESBLs大腸埃希菌發病率逐漸增高，且各地區流行的基因亞型各不相同。近年來國內有關TEM 型ESBLs報道不斷增多，TEM主要包括TEM-1型和TEM-2型，并發現了許多新的亞型，但目前尚未見惠東地區該酶的分子流行病學研究報道。TEM-1型ESBLs酶是革蘭陰性菌最常見的β-內酰胺酶[9]。既往文獻報道90%以上大腸埃希菌對氨芐西林耐藥是由TEM-1 型ESBLs所介導[10]。TEM-1 型ESBLs能夠水解青霉素以及頭孢類抗菌藥物，從而導致細菌的耐藥。TEM-2型是由TEM-1型單個氨基酸的替換衍生而來。研究表明，不同的基因類型可導致同一種抗菌藥物對產ESBLs大腸埃希菌的敏感性不同[11]。因此，積極尋找不同基因型ESBLs大腸埃希菌的生物學特點對于指導抗菌藥物的選擇及應用具有重要的臨床意義。本研究結果在一定程度上反應惠東地區產ESBLs大腸埃希菌的流行病學情況，耐藥基因主要類型和堿基突變位點，以及對抗菌藥物的敏感性，從而在一定能夠程度上彌補了本地區產ESBLs大腸埃希菌流行病學情況的空白，也在一定程度上為臨床醫師抗菌藥物的選擇提供理論。

綜上所述，筆者認為，在今后研究中，可進一步增加樣本收集量，從而使該項研究結果具有更好的代表性。

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