高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中氨基甲酸酯類的殘留

洪 波 萬譯文 劉伶俐 劉 麗

（湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410153）

氨基甲酸酯類農(nóng)藥是一類廣譜性農(nóng)藥，在農(nóng)作物栽培過程中，特別是在種子處理上，氨基甲酸酯類殺蟲劑得到廣泛的應(yīng)用。然而，當(dāng)此類物質(zhì)進(jìn)入到水體后會(huì)在魚體和其它水生生物體內(nèi)富集，被認(rèn)為是對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境和人類有害的藥物，因此很有必要加強(qiáng)對(duì)水產(chǎn)品中該類物質(zhì)的監(jiān)測(cè)。

目前中國還沒有制定相應(yīng)的水產(chǎn)品檢測(cè)國家標(biāo)準(zhǔn)，據(jù)報(bào)道的關(guān)于動(dòng)植物源性食品中氨基甲酸酯類農(nóng)藥的測(cè)定方法有氣相色譜法［1］、氣相色譜／質(zhì)譜聯(lián)用法（GC／MS）［2］、高效液相色譜法［3－5］、超臨界流體色譜法［6，7］、高效液相 色 譜－串聯(lián)質(zhì)譜法［8，9］。在采用凝膠滲透 凈 化技術(shù)［10］凈化樣品，以高效液相色譜法－紫外檢測(cè)器檢測(cè)過程中發(fā)現(xiàn)，凝膠滲透凈化技術(shù)能分離大分子類干擾雜質(zhì)，但用在水產(chǎn)品檢測(cè)上存在分離不完全和溶劑用量大的缺陷。本試驗(yàn)采用丙酮／二氯甲烷提取水產(chǎn)品試樣，提取液經(jīng)濃縮后，采用固相萃取技術(shù)進(jìn)行凈化處理再濃縮定容，樣品使用帶紫外檢測(cè)器的高效液相色譜進(jìn)行檢測(cè)，以期為水產(chǎn)品中氨基甲酸酯類農(nóng)藥多組分殘留的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑、儀器與供試樣品

1.1.1 試劑

丙酮、二氯甲烷、甲醇：色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

乙腈：色譜純，美國Tedia公司；

氯化鈉：優(yōu)級(jí)純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

磷酸：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

甲醇－二氯甲烷（V／V ＝5／95）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器

高效液相色譜儀（配紫外檢測(cè)器）：Waters2489，美國Waters公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE－52AA，上海亞榮生化儀器廠；

高速冷凍離心機(jī)：Z323K，德國Hemel公司；

超聲波清洗器：KQ5200DE，昆山超聲波儀器廠；

氨基固相萃取柱：500mg／6mL，美國Varian公司。

1.1.3 供試樣品

草魚、對(duì)蝦、鱈魚：均為無公害檢測(cè)的陰性樣，市售。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配置

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制 分別稱取涕滅威、甲萘威、克百威各5mg，速滅威、異丙威各10 mg，用甲醇溶解并定容至10.0mL，冰箱－18 ℃保存。涕滅威、甲萘威、克百威溶液濃度5g／L，速滅威、異丙威溶液濃度10g／L。

1.2.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別吸取1.2.1中標(biāo)準(zhǔn)溶液各2.0mL置于10mL容量瓶中，加流動(dòng)相至刻度。此溶液含涕滅威、甲萘威、克百威各1.00 mg／L，速滅威、異丙威各2.00mg／L。

1.3 樣品處理

準(zhǔn)確稱取20.00g搗碎、混勻的樣品于100 mL 具塞塑料離心管中，加入5g無水硫酸鈉和混合提取液（25mL丙酮＋25mL二氯甲烷＋200μL 磷酸），均質(zhì)1min，加入6g氯化鈉，超聲提取10 min，5 000r／min離心10 min，取25 mL提取液到雞心瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，加入2mL 乙腈溶解殘?jiān)^柱。

用乙腈活化氨基固相萃取柱，轉(zhuǎn)移提取液到柱上，然后在雞心瓶中加入2mL乙腈重復(fù)清洗1次，一并轉(zhuǎn)移到柱上。繼續(xù)用5mL 乙腈清洗柱子，最后用4mL 的甲醇－二氯甲烷溶液洗脫，收集洗脫液用40 ℃氮吹干。用流動(dòng)相溶解殘?jiān)⒍ㄈ莸?mL，過0.45μm 濾膜供液相色譜測(cè)定。

1.4 色譜條件

色譜柱：Waters ODS－C18柱（250mm×4.6mm，5μm），柱溫35 ℃，進(jìn)樣量20μL，流動(dòng)相：甲醇＋水＝50＋50，流速、吸收波長(zhǎng)時(shí)間變化（見表1）。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取液的選擇

參照文獻(xiàn)［4］、［11］和［12］，分別對(duì)不同提取液（①25mL乙腈；②25mL乙腈＋200μL磷酸；③25mL甲醇；④25mL丙酮＋25mL二氯甲烷＋200μL磷酸）進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明：用提取液①進(jìn)行提取時(shí)干擾物質(zhì)會(huì)大量富集在提取液中且難以除去；用提取液③進(jìn)行提取時(shí)同樣會(huì)有干擾物過多的富集且涕滅威、異丙威回收率僅在30.50%～46.20%；用提取液②進(jìn)行提取時(shí)雖減少了富集問題卻出現(xiàn)速滅威的回收率很低的情況；而選擇提取液④對(duì)分析無干擾，且提取效果好，回收率均在62.40%以上，故而選擇25 mL 丙酮＋25mL二氯甲烷＋200μL磷酸進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表1 流速、吸收波長(zhǎng)時(shí)間變化表Table 1 Velocity，absorption wavelength change of time table

2.2 凈化方式的選擇

經(jīng)凝膠層析柱凈化和氨基固相萃取柱凈化方式的比對(duì)試驗(yàn)，并參考加速溶劑萃取方法［3］和超臨界流體萃取方法［6］。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：采用磷酸沉淀蛋白后，使用氨基固相萃取小柱（圖1）對(duì)提取液進(jìn)行凈化和濃縮的效果與GB／T 5009.163——2003凈化方式（圖2）相比較，固相萃取凈化方式具有節(jié)省時(shí)間、溶劑用量少、不易乳化等特點(diǎn)。氨基固相萃取柱對(duì)氨基甲酸酯類農(nóng)藥幾乎沒有保留，通過固相柱后，可有效除去樣品的雜質(zhì)干擾物，從而起到更好凈化的效果。

2.3 最大吸收波長(zhǎng)的選擇

試驗(yàn)使用5種氨基甲酸酯混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在紫外吸收 區(qū)域選取了吸收波長(zhǎng)為190，195，200，205，210，220，250nm的7個(gè)點(diǎn)，分別進(jìn)行進(jìn)樣分析，記錄5種氨基甲酸酯的在不同吸收波長(zhǎng)下的峰面積見表2。結(jié)果表明：在195nm波長(zhǎng)時(shí)（圖3）涕滅威、速滅威、克百威、異丙威有最大的吸收峰，而甲萘威的最大吸收波長(zhǎng)為220nm（圖4）。以此，最終選用樣品分析時(shí)及時(shí)變換195，220nm（圖5）兩個(gè)吸收波長(zhǎng)來對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定。

圖1 氨基固相萃取柱凈化分析色譜圖Figure 1 SPE chromatography purification of amino analysis diagram

圖2 凝膠層析柱凈化分析色譜圖Figure 2 Gel chromatography purification of amino analysis diagram

2.4 線性范圍和最低檢出限

分別吸取1.2.2中溶液0.50，1.00，5.00，10.0mL置于10mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容，溶液中涕滅威、甲萘威、克百威的濃度各為0.05，0.10，0.50，1.00，2.00μg／mL，速滅威、異丙威的濃度各為0.10，0.20，1.00，2.00，4.00μg／mL，等體積進(jìn)樣進(jìn)行分析檢測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明：在上述濃度范圍內(nèi)，峰面積與溶液濃度呈良好的線性關(guān)系，線性方程與相關(guān)系數(shù)見表3。

表2 5種氨基甲酸酯的在不同吸收波長(zhǎng)下的峰面積Table 2 5kinds of carbamate in different absorption wavelength of peak area

圖3 195nm 時(shí)5種氨基甲酸酯分析圖譜Figure 3 195nm 5carbamate analysis map

圖4 220nm 時(shí)5種氨基甲酸酯分析圖譜Figure 4 220nm 5carbamate analysis map

圖5 變波長(zhǎng)時(shí)5種氨基甲酸酯分析圖譜Figure 5 Variable wavelength of 5carbamate analysis map

表3 5種氨基甲酸酯線性范圍和最低檢出限Table 3 5kinds of carbamate linear range and detection limit

2.5 方法回收率

在魚糜樣品中分別加入濃度為0.20，1.00μg／mL 的5種氨基甲酸酯農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行方法回收率試驗(yàn)。由表4 可知，5 種氨基甲酸酯農(nóng)藥的加標(biāo)平均回收率在62.40%～90.25%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在1.46%～9.32%，5種氨基甲酸酯回收率都很高，而且重復(fù)性和可現(xiàn)性都很好，其中涕滅威的平均回收率最高，達(dá)90.25%。

3 結(jié)論

本方法是在文獻(xiàn)［13］、［14］的基礎(chǔ)上，從改變吸收波長(zhǎng)降低檢出限方面進(jìn)行改進(jìn)。但使用變波長(zhǎng)會(huì)使基線產(chǎn)生一定波動(dòng)，所以要求樣品中各組分之間要一定的保留時(shí)間差。后續(xù)研究考慮將梯度洗脫方法運(yùn)用于此樣品分析中，期望可以得到更好的分離效果和縮短分析時(shí)間。

表4 5種氨基甲酸酯回收率Table 4 5kinds of carbamate recycle rate

1 陳霞，張雪梅，楊華梅，等.凝膠滲透色譜－氣相色譜法測(cè)定蔬菜中24種有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留［J］.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2009，19（1）：75～76.

2 邊照陽，唐綱嶺，張洪非，等.煙草中二硫代氨基甲酸酯農(nóng)藥殘留量的測(cè)定［J］.煙草科技，2011（3）：47～50.

3 吳剛，王華雄，俞春燕，等.加速溶劑萃取－GPC 液相色譜柱后衍生化測(cè)定動(dòng)物源性食品中多種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量［J］.中國食品衛(wèi)生雜志，2008（5）：409～413.

4 劉長(zhǎng)武，劉瀟威，翟廣書，等.固相萃取－高效液相色譜法測(cè)定蔬菜、水果中的氨基甲酸酯殺蟲劑及其代謝物殘留［J］.色譜，2003，21（3）：255～257.

5 龔文杰，馬建明，鄔晨陽，等.高效液相色譜柱后衍生法測(cè)定環(huán)境水樣中氨基甲酸酯殘留化學(xué)測(cè)定方法［J］.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2005，15（7）：283～285.

6 Lehotay S J，Valverde－García A.Evaluation of different solidphase traps for automated collection and clean－up in the analysis of multiple pesticides in fruits and vegetables after supercritical fluid extraction［J］.J.Chromatogr A，1997，765（1）：69～84.

7 spectrometry，Lehotay S J，Eller K I，et al.Development of a method of analysis for 46pesticides in fruits and vegetables by supercritical fluid extraction and gas chromatography／ion trap mass［J］.JAOAC Int.，1995，78（3）：821～830.

8 陳笑梅，胡貝貞，劉海山，等.高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定糧谷中9種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留［J］.分析化學(xué)研究簡(jiǎn)報(bào)，2007，35（1）：106～110.

9 趙穎，蔣施，金雁，等.食用菌中多種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定研究［J］.化學(xué)通報(bào)，2012（2）：56～60.

10 中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品研究所.GB／T 5009.163——2003動(dòng)物性食品中氨基甲酸酯類農(nóng)藥多組分殘留高效液相色譜法測(cè)定［S］.北京：中華人民共和國衛(wèi)生部，2004.

11 邵金良，黎其萬，劉宏程，等.高效液相色譜法測(cè)定蔬菜中8種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留［J］.現(xiàn)代食品科技，2011，10（7）：856～861.

12 朱銘立，張衛(wèi)峰，聶建榮，等.高效液相色譜測(cè)定水產(chǎn)品中氨基甲酸酯類農(nóng)藥多組分殘留［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（8）：244～245.

13 程盛華，唐斌，鄭龍，等.在線柱后衍生－熒光檢測(cè)－高效液相色法測(cè)定果蔬中殘留氨基甲酸酯農(nóng)藥［J］.理化實(shí)驗(yàn)室－化學(xué)分冊(cè)，2010，46（7）：816～819.

14 諸葛慶，李博斌，江濤，等.固相萃取－高效液相色譜法測(cè)定黃酒中氨基甲酸乙酯［J］.釀酒科技，2012（1）：112～115.