HPLC測定采后蓮霧果實中可溶性糖含量及在貯藏期的變化

陳 靜 吳光斌 陳發河

（集美大學生物工程學院，福建 廈門 361021）

蓮霧（Syzygium samarangense merr.et perry.）又稱洋蒲桃、甜霧、爪哇蒲桃等，為桃金娘科（myartecae）蒲桃屬植物。其果實色澤艷麗、果形獨特、風味清香，清甜多汁，且富含維生素及礦物元素，被稱為“水果皇帝”［1］。但是由于蓮霧果實含水量較高92.87%，果肉組織幼嫩，極不耐貯運［2］；且采后果實呼吸代謝旺盛，衰老速度快，若不及時處理，短時間內果肉組織就會失水萎縮，發生絮狀綿軟現象，使其食用品質急劇下降，進而腐爛變質。蓮霧果實采后的這種果肉軟化劣變類型不同于目前已知的軟化類型，關于其采后絮狀綿軟進程的機理還鮮有報道。筆者發現隨著貯藏時間的延長，除了水分大量散失外，果肉的絮狀綿軟組織大小會增大，果肉組織中心甚至出現中空，這可能是由于蓮霧果實采后呼吸代謝和物質代謝過程中造成的部分物質虧損。

蓮霧果實中除水分外，主要物質成分為碳水化合物，約占5.97%，且以可溶性糖為主，其余成分含量均很少［2］。關于蓮霧果實采后香氣成分、有機酸以及一些營養成分的研究報道比較多［3－6］，而可溶性糖成分和含量還未有報道。目前，一般化學法只用來測定總糖含量不能分別測定各種糖含量，有研究［7］表明，該法測得的葡萄糖、果糖值比實際值略高；色譜法在糖酸類化合物的分析中已有不少應用［8－10］。本試驗以臺灣蓮霧主栽品種“黑珍珠”為試驗材料，采用高效液相色譜法分析采后蓮霧果肉中可溶性糖成分及含量變化，以期為進一步從物質代謝水平探明蓮霧果實采后果肉絮狀綿軟發生的機理及其調控因子提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蓮霧：黑珍珠，臺灣屏東縣泰吉果菜生產合作社；

果糖、葡萄糖和蔗糖標準品：中國藥品生物制品鑒定所；

乙腈：色譜純，美國天地公司；

無水乙醇：分析純，西隴化工股份有限公司；

試驗用水（18 MΩ·cm）：本實驗室用Millipore Milli Q RG 超純水系統制備。

1.2 主要儀器

電子天平：AL104型，梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司；

高效液相色譜儀：Waters 1525型，美國Waters公司；

旋轉蒸發儀：RE－52AA 型，上海亞榮生化儀器廠；

離心機：KDC－1044型，科達創新股份有限公司；

恒溫恒濕箱：PSX－280H 型，寧波萊?？萍加邢薰?。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理 當日到達廈門口岸的蓮霧果實，選擇成熟度基本一致，大小均勻，無機械損傷和病蟲害侵染的，置于溫度25 ℃±2 ℃和濕度80%±2%的恒溫恒濕箱中貯藏。

1.3.2 色譜條件 Carbohydrate 柱（4.0μm，4.6 mm×250mm，Waters），流動相為乙腈／水＝90／10（V／V），流速1.5mL／min，柱溫45℃，進樣量20μL，Waters 1525泵，Waters 2414示差檢測器。以保留時間定性，峰面積定量。

1.3.3 樣品的制備 參照Ding［11］和盧彩玉［12］等的方法并加以改進，具體步驟如下：蓮霧果肉冰浴研磨后稱取5.0g，樣品加入10mL 80%乙醇，35 ℃下提取30min，4 000r／min離心10min，取上清。殘渣重復提取3次，合并上清液定容至25mL，取5.0mL于40 ℃旋轉蒸發儀蒸干后，用5.0mL超純水溶解。進樣前用0.45μm 微孔濾膜過濾。

1.3.4 糖標準溶液的配制 準確稱取0.500 0g經干燥至衡重的果糖、葡萄糖和蔗糖，轉移至25mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，得質量濃度為20mg／mL 的混標母液，逐級稀釋至0.625，1.25，2.5，5，10mg／mL 的標準溶液。上機進樣前用0.45μm 微孔濾膜過濾。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

2.1.1 流動相的選擇 采用Waters Carbohydrate柱以不同體積比的流動相（乙腈／水＝75／25，80／20，85／15，90／10）來測定混標液和蓮霧提取液中果糖、葡萄糖、蔗糖的分離情況和含量。結果表明，隨著乙腈比例的增加，3種糖的分離度提高，但相應的分析時間會延長。當流動相中乙腈／水＝90／10（V／V）時3種糖的分離效果較好，16min就可以完成1個樣品分析，兼顧分離度和分析時間，本試驗確定的流動相為乙腈／水＝90／10（V／V）。

2.1.2 流速的選擇 比較流動相流速在1.0，1.2，1.3，1.4，1.5mL／min條件下3種糖的分離情況。結果表明，在流速為1.5mL／min時，3種糖的出峰時間較短，峰形較好。

2.1.3 柱溫的選擇 在30，35，40，45，50 ℃條件下進行糖混標液和蓮霧提取液中可溶性糖的分析。結果表明，隨著溫度升高，3種糖的保留時間有所縮短，但分離度降低。兼顧分離度和保留時間本試驗確定色譜柱柱溫為45 ℃。

2.2 方法的線性范圍和檢出限

按1.3中的分析條件進行測定，以不同糖濃度混標峰面積y 為縱坐標，標樣濃度x（mg／mL）為橫坐標繪制標準曲線?；貧w方程及相關系數見表1。

表1 標準曲線的回歸方程、相關系數和線性范圍Table 1 Regression equations，correlation coefficients and linear ranges for fructose，glucose and sucrose

以信噪比S／N ＝3計算果糖、葡萄糖、蔗糖的檢出限，分別為0.12，0.21，0.03mg／mL。試驗結果表明，果糖、葡萄糖和蔗糖在0.625～20mg／mL 范圍內，濃度與峰面積有良好的線性關系，相關系數均達到了0.999以上。

2.3 色譜圖

在1.3.2色譜條件下，得到果糖、葡萄糖和蔗糖標樣的色譜圖，其相鄰峰的分離度較好，分析時間較短，整個分析過程在16min內完成（圖1）。

圖1 混標色譜圖Figure 1 HPLC chromatogram of the standard of mixed fructose，glucose and sucrose

2.4 加標回收率與精密度

采用加標法測定回收率［13］。將樣品提取液等分為4份，其中3份分別添加一定量的標準品，1份不加，同時定容至5mL。經0.45μm 微孔濾膜過濾后，按照1.3的色譜條件進行分析測定可溶性糖含量，計算果糖、葡萄糖蔗糖的平均回收率。試驗表明（表2），果糖、葡萄糖、蔗糖的回收率在99.05%～106.39%，說明該方法具有較高的準確度。

表2 加標回收率Table 2 Spike recoveries and relative standard deviations in a real sample（n＝3）

對同一待測提取液重復進樣6次，測定峰面積，通過計算相對標準偏差（RSD）考察此測定方法的精密度，經測定果糖、葡萄糖、蔗糖峰面積的RSD 分別為2.63%，3.98%，2.55%，結果表明該方法的精密度良好。

2.5 樣品分析

按照1.3色譜條件對樣品進行分析，測得采后蓮霧果實中的可溶性糖主要為果糖、葡萄糖和蔗糖，樣品色譜圖見圖2。進一步測定采后貯藏期（25 ℃）蓮霧果實中可溶性糖含量，結果（表3）表明，采后蓮霧果實中的可溶性糖主要以單糖為主，整個貯藏期內果糖和葡萄糖含量的變化趨勢相似，蔗糖含量一直處于減少的狀態。

圖2 蓮霧果實樣品色譜圖Figure 2 HPLC chromatogram of Syzygium samarangense

3 結論

通過高效液相色譜法測定蓮霧果實采后的可溶性糖組分及含量，結果表明主要為果糖、葡萄糖和蔗糖，且該方法中3種糖能得到較好的分離，保留時間重現性較好，加標回收率準確性高，可以作為分析檢測蓮霧果實中糖組分和含量的一種簡便、快速、準確的方法。為進一步研究蓮霧果實采后物質代謝過程及果肉絮狀綿軟進程調控機理和貯藏保鮮技術提供理論數據。

表3 蓮霧采后可溶性糖含量Table 3 The content of soluble sugar in wax apple after harvest

采后蓮霧果實內的具體的可溶性糖變化還需與采后的生理變化及物質代謝相關酶進行綜合分析及多次的實驗驗證；至于蓮霧果實中物質代謝及其對果肉絮狀綿軟的影響尚待進一步的研究。

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