ε－聚賴氨酸復合防腐劑對常見致病菌和污染菌的抑制作用

莫樹平王惠惠柏建玲

張菊梅1，2，3，4吳清平1，2，3，4丘明泉1，2，3，4

（1.廣東省微生物研究所，廣東 廣州 510070；2.廣東省菌種保藏與應用重點實驗室，廣東 廣州 510070；3.廣東省微生物應用新技術公共實驗室，廣東 廣州 510070；4.廣東省華南應用微生物重點實驗室－省部共建國家重點實驗室培育基地，廣東 廣州 510070）

ε－聚賴氨酸是一種具有抑菌功效的多肽，由25～30個賴氨酸殘基聚合而成。ε－聚賴氨酸具有優良的抑菌效果，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、酵母菌、霉菌均有一定的抑菌作用，并且對一些耐熱性芽孢桿菌和病毒也有一定抑制作用。同時，ε－聚賴氨酸還具有熱穩定性好、水溶性強、安全性高、不影響食品風味等特點［1－3］。

乳酸鏈球菌、納他霉素是中國衛生部正式批準使用的食品防腐劑，安全健康、抑菌效果好，但兩者抑菌譜相對較窄，ε－聚賴氨酸抑菌譜廣、水溶性強、安全性高，三者復配使用，抑菌效果增強，抑菌譜互補，擴展了抑菌譜，有很大的開發應用前景［4］。目前，ε－聚賴氨酸在日本、韓國、美國等已經批準作為新型生物食品添加劑使用，廣泛應用于肉類［5，6］、家禽、海產品、面包、米飯、蛋糕、餅干［7］、飲料［8］、醬油等食 品中。而中國相關法律法規尚不完善，ε－聚賴氨酸尚未列入食品添加劑目錄［9，10］。

本研究團隊的前期研究工作表明［11－13］，以ε－聚賴氨酸為主要防腐劑，與乳酸鏈球菌素和納他霉素進行復配優選得到的生物防腐劑，對廣式臘腸、禽畜魚類、生鮮肉等食品中的常見污染菌均有良好的防腐效果。

本試驗選取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌等致病菌和酵母、乳酸菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉等食品中常見污染菌，采用紙碟法，有針對性的進行抑菌試驗，評估復合生物防腐劑對這些常見致病菌的抑制作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

乳酸鏈球菌素（Nisin）：食品級，廣東大地食用化工有限公司；

納他霉素：食品級，廣東大地食用化工有限公司。

1.1.2 試驗菌株

大腸 桿 菌（Escherichia coli，8099）、金 黃 色 葡 萄 球 菌（Staphylococcus aureus，ATCC6538）、白色念珠菌（Candida albicans，ATCC10231）、枯 草 芽 孢 桿 菌（Bacillus subtilis，ATCC9372）、黑曲菌（Aspergillus niger，ATCC16404）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，ATCC15442）、清酒酵 母 （Saccharomy ces sake，ACCC20045）、嗜 酸 乳 桿 菌（Lactobacillus acidophilus，ATCC4356）：廣東省菌種保藏與應用重點實驗室。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗準備 將指示菌菌種接種于試管斜面培養基上，37 ℃培養24h，轉接兩次將菌種活化，菌種活化后，接入液體培養基，37 ℃振蕩培養24h，制備菌懸液；稱取乳酸鏈球菌素、納他霉素與ε－聚賴氨酸，用去離子水配制成2%濃度的配方溶液；用打孔器制作直徑0.6cm 的圓形濾紙片。

1.2.2 乳酸鏈球菌素、納他霉素與ε－聚賴氨酸的抑菌試驗

采用紙碟法，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢桿菌、黑曲菌、銅綠假單胞菌、酵母菌和乳酸菌為指示菌，取0.1mL指示菌菌懸液于培養基平板，用滅菌刮鏟涂布均勻，放置浸泡過濃度2%的乳酸鏈球菌素、納他霉素和ε－聚賴氨酸溶液的圓形濾紙片，37 ℃恒溫培養24h，觀察抑菌圈的有無，初步評估抑菌效果。

1.2.3 復合生物防腐劑的抑菌試驗 以ε－聚賴氨酸為主要原料，按一定比例添加Nisin、納他霉素等復配制成復合生物防腐劑，前期通過預試驗獲取了抑菌效果較佳的9 個配方（見表1），采用紙碟法，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢桿菌、黑曲菌、銅綠假單胞菌、酵母菌及乳酸菌為指示菌，取0.1mL指示菌菌懸液于培養基平板，用滅菌刮鏟涂布均勻，放置浸泡過2%復合生物防腐劑的圓形濾紙片，以空白圓形濾紙片作對照，37 ℃恒溫培養24h，觀察抑菌圈的有無，初步評估抑菌效果。

表1 復合生物防腐劑各復配組配方Table 1 Complex biological preservatives formula／（g·kg－1）

1.2.4 ε－聚賴氨酸、乳酸鏈球菌素、納他霉素及復合生物防腐劑的抑菌試驗 采用紙碟法，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢桿菌、黑曲菌、銅綠假單胞菌、酵母菌和乳酸菌為指示菌，取0.1mL 指示菌菌懸液于培養基平板，用滅菌刮鏟涂布均勻，放置分別經2%的乳酸鏈球菌素、納他霉素、ε－聚賴氨酸及復合生物防腐劑溶液浸泡過的圓形濾紙片，37 ℃恒溫培養24h，測量抑菌圈的直徑，評估比較各防腐劑的抑菌效果。

2 結果與分析

2.1 乳酸鏈球菌素、納他霉素與ε－聚賴氨酸的抑菌效果

由表2可知，乳酸鏈球菌素能有效地抑制革蘭氏陽性細菌如金黃色葡萄球菌、乳酸菌、枯草芽孢桿菌的生長，但對革蘭氏陰性細菌如大腸桿菌、銅綠假單胞和酵母菌等沒有抑菌效果；納他霉素能有效地抑制革蘭氏陰性細菌大腸桿菌、真菌白色念珠菌、黑曲霉和酵母菌的生長，但對陽性細菌沒有抑制效果；ε－聚賴氨酸對革蘭氏陽性細菌金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、乳酸菌與革蘭氏陰性細菌大腸桿菌、銅綠假單胞菌及真菌白色念珠菌、黑曲霉和乳酸菌均有抑菌效果。

2.2 復合生物防腐劑的抑菌效果

由表3可知，復合生物防腐劑對革蘭氏陽性細菌金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、乳酸菌與革蘭氏陰性細菌大腸桿菌、銅綠假單胞菌及真菌白色念珠菌、黑曲霉和乳酸菌均有抑菌效果。與乳酸鏈球菌素、納他霉素、ε－聚賴氨酸相比，復合生物防腐劑的抑菌效果得到互補，抑菌譜拓寬。

2.3 ε－聚賴氨酸、乳酸鏈球菌素、納他霉素及復合生物防腐劑的抑菌效果

ε－聚賴氨酸、乳酸鏈球菌素、納他霉素及復合生物防腐劑的抑菌效果見表4。

表2 乳酸鏈球菌素、納他霉素與ε－聚賴氨酸的抑菌效果Table 2 Nisin，Natamycin andε－polylysine bacteriostasis effect

表3 復合生物防腐劑的抑菌效果Table 3 The bacteriostatic effects of complex biological preservatives

表4 各防腐劑的抑菌圈直徑Table 4 The antiseptic antibacterial circle diameter ／cm

由表4可知，相比各單體防腐劑，乳酸鏈球菌素、納他霉素與ε－聚賴氨酸的復配擴展了抑菌譜，復合生物防腐劑對指示菌中的革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌和真菌均表現出了抑菌作用；單體防腐劑的復配同時也加強了抑菌效果，復合生物防腐劑4、5、7對乳酸菌的抑菌圈直徑達到了1.8cm以上，復合生物防腐劑9 對白色念珠菌的抑菌圈直徑為1.7cm，明顯強于其它防腐劑的抑菌效果。

3 討論

乳酸鏈球菌素是一種高效、無毒、安全、無副作用的天然食品防腐劑，能有效抑制革蘭氏陰性菌，對革蘭氏陽性菌、霉菌等無效；納他霉素是一種天然、廣譜、高效安全的真菌抑制劑，常用于食品的表面防腐；聚賴氨酸是一種具有抑菌功效的多肽，具有抑菌譜廣、水溶性好、安全性、抑菌范圍廣等特點。3種防腐劑復配后的復合生物防腐劑擴展了抑菌譜，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌都表現出了顯著的抑菌作用。

單體防腐劑的復配不但擴展了抑菌譜，而且增強了對指示菌的抑菌作用。復合生物防腐劑3、4、7對乳酸菌的抑菌效果明顯強于其它單體防腐劑及復配組合，復合生物防腐劑7對乳酸菌的抑菌圈直徑為2.2cm，明顯大于乳酸鏈球菌素和ε－聚賴氨酸對乳酸菌的抑菌圈直徑1.6，1.2cm。

ε－聚賴氨酸安全、易分解，不僅在食品業有廣泛的應用，在醫藥、環保等領域的應用也有不斷拓展。目前，ε－聚賴氨酸在日本已經實現產業化生產，中國尚處于實驗室研發階段。篩選產ε－聚賴氨酸的高產菌株，提高ε－聚賴氨酸的產量，實現產業化生產將是今后的重點研究工作。

1 Shih I L，Shen M H，Van Y T.Microbial synthesis of poly（ε－lysine）and its various applications［J］.Bioresource Technology，2006（97）：1 148～1 159.

2 Najjar M B，Kashtanov D，Chikindas M L.Natural antimicrobialsε－poly－L－lysine and nisin A for control of oral microflora［J］.Probiotics ＆Antimicro.Prot.，2009（1）：143～147.

3 劉德雄，陳中.復合添加劑對金黃色葡萄球菌的抑制效果研究［J］.現代食品科技，2011，27（12）：1 443～1 445，1 460.

4 吳慧清，吳清平，張菊梅，等.殼聚糖復合防腐劑對新鮮豬肉冷藏的保鮮效果［J］.食品與機械，2012，28（3）：211～213.

5 劉驍，謝晶，林永艷.復合生物保鮮劑對豬肉保鮮的研究［J］.食品與機械，2011，27（6）：199～203.

6 馬濤，周大宇.ε－聚賴氨酸對月餅表皮防腐效果的研究［J］.食品科學，2008，29（12）：215～218.

7 程濤，吳超，岳喜慶.聚賴氨酸在食醋防腐中的應用［J］.農業科技與裝備，2008（3）：71～73

8 李昆侖，李江闊，張鵬，等.ε－聚賴氨酸在食品中應用的研究進展［J］.保鮮與加工，2010（1）：11～15.

9 梅叢笑，方元超，趙晉府.幾種天然食品防腐劑的應用簡介［J］.中國食品添加劑，2000（4）：60～62.

10 江秋安.天然食品保鮮劑及其應用［J］.江蘇食品與發酵，2000（3）：36～38.

11 張菊梅，石立三，吳清平，等.復合防腐劑對幾種常見畜禽魚肉的防腐效果研究［J］.現代食品科技，2009（10）：1 174～1 176.

12 莫樹平，張菊梅，吳清平，等.ε－聚賴氨酸復合生物防腐劑對廣式臘腸的防腐效果研究［J］.食品研究與開發，2010，31（12）：224～229.

13 莫樹平，林苑苑，張菊梅，等.生鮮肉類復合生物防腐保鮮劑的開發研究［J］.食品科技，2011，36（12）：124～127，131.