高速逆流色譜分離純化紫甘藍花色苷

易建華 潘毛頭 朱振寶

（陜西科技大學生命科學與工程學院，陜西 西安 710021）

紫甘藍（red cabbage）又稱赤甘藍、紅甘藍，屬十字花科，是結球甘藍的一個類型，它營養(yǎng)豐富，含豐富的VC，VE。研究表明：紫甘藍花色苷具有一定的還原能力和較強的抗脂質過氧化能力，能降低血清中的脂肪含量［1］，并對DPPH 自由基的清除有較強的效果［2，3］。目前，紫甘藍花色苷的提取及純化方法有水提取法、有機溶劑提取法、超聲波提取法、大孔樹脂法和凝膠過濾法等［4，5］，但是這些大多數(shù)是傳統(tǒng)方法，提取花色苷的量較少，純度較低，也無法用高效液相色譜法（HPLC）完全分離出來一種或多種組分。

高速逆流色譜（high－speed counter－current chromatography，HSCCC）是利用物質在兩相中分配系數(shù)的不同而實現(xiàn)分離的一種色譜技術。與傳統(tǒng)的液－固色譜相比，它具有高效、快速、操作簡單、回收率高、制備量大等的優(yōu)點，已經被廣泛應用于天然產物的分離純化和食品原料的開發(fā)利用等領域［6－10］。

本試驗以紫甘藍為原料，采用超聲波溶劑輔助法提取分離花色苷，并用高速逆流色譜法對花色苷進行進一步的分離純化，得到純度比較高的花色苷，為紫甘藍花色苷的進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

紫甘藍：產地為陜西西安；

LSA－21大孔樹脂：西安藍曉科技有限公司；

甲醇、乙醇：分析純，市售；

乙腈、正丁醇、甲基叔丁基醚：色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司；

三氟乙酸：化學純，上海科豐化學試劑有限公司；

試驗用水：去離子水。

1.1.2 主要儀器設備

高效液相色譜儀：Waters2487，美國Waters公司；

紫外－可見分光光度計：UV－2600型，上海尤尼柯儀器有限公司；

高速逆流色譜儀：TBE－300A，上海同田生物技術有限公司；

樹脂柱：1m×4cm，上海錦華儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 超聲波溶劑輔助法提取紫甘藍中的花色苷 采用65%乙醇超聲波輔助提取花色苷。取1kg 新鮮紫甘藍，料液比1∶5（m／V），調節(jié)pH 為2.5，超聲波功率為200 W，溫度40 ℃，提取時間為8min，過濾，合并濾液，60 ℃下減壓濃縮，得花色苷粗提液。花色苷粗提液通過LSA－21大孔樹脂柱吸附處理，然后分別用3BV 的蒸餾水和3BV 30%，50%，75%的乙醇依次洗脫，流速為2BV／h，收集洗脫液，濃縮，冷凍干燥，得到紫甘藍花色苷粉末1.73g，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 HSCCC溶劑系統(tǒng)及樣品溶液的制備 以正丁醇－甲基叔丁基醚－乙腈－水－三氟乙酸體積比為2∶2∶1∶5∶0.01的比例配制兩相溶劑系統(tǒng)，搖勻使其充分混合，待兩相溶液平衡后，分別置于棕色廣口瓶中，其中上相為固定相，下相為流動相。

將配好的上相和下相超聲脫氣20min，然后稱取紫甘藍花色苷粉末300mg，溶于10mL 的上相與10mL 下相溶液中，用0.45μm 微孔濾膜過濾，備用。

1.2.3 HSCCC 的分離方法 進樣前，開啟循環(huán)水浴儀，將溫度設定為25 ℃，以9mL／min的速度將固定相泵入主機，待固定相充滿螺線管后，開啟主機電源，緩慢正向調節(jié)轉速至800r／min，等轉速穩(wěn)定后，以2mL／min的速度泵入流動相，待整個系統(tǒng)建立動態(tài)平衡后，將20mL 樣品溶液通過進樣孔注入六通閥內，開始分離，并在254nm 波長下采集數(shù)據(jù)，按照色譜峰收集流分，流分由自動接收器收集，流速設定為3mL／min，每6mL收集1管。

1.2.4 HSCCC兩相分配系數(shù)的測定 根據(jù)文獻［9～11］，修改如下：采用HPLC測定樣品在兩相中的分配系數(shù)。取花色苷粗提樣1～2mg，溶于2mL 上相與2mL 下相溶液中，搖勻使樣品充分溶解。待分配平衡后，分離上下相，并分別量取上相和下相各1mL，用HPLC檢測分析，按式（1）計算不同溶劑分配系數(shù)K 值：

式中：

K—— 化合物在兩相中的分配系數(shù)；

A1—— 上相中化合物的峰面積；

A2—— 下相中化合物的峰面積。

1.3 HPLC檢測分析

采用HPLC分析紫甘藍花色苷粗提物，以及經HSCCC分離出來的各組分。色譜條件：反相C18柱（Diamonsil C18，5μm，250×4.6mm），流動相：洗脫劑（A）2%的甲酸乙腈溶液，洗 脫 劑（B）2% 的 甲 酸 水 溶 液（pH 2.57）。流 速：1.0mL／min；柱 溫：20 ℃；進 樣 體 積：20 μL；進 樣 濃 度：1mg／mL；檢測波長：525nm。

2 結果與討論

2.1 紫甘藍花色苷提取物制備方法的選擇

目前，提取花色苷的方法一般是水提取法和溶劑提取法。但是水提法提取時間長、提取率低、雜質較多，而有機溶劑提取法消耗大、費用高、且易造成環(huán)境污染，也不適用于大量制備［4－6］。本試驗采用超聲波輔助溶劑提取法提取紫甘藍花色苷，分別以乙醇濃度、提取時間、提取溫度、超聲波頻率、料液比等為影響因素，在單因素的基礎上，選擇提取時間、提取溫度、乙醇體積分數(shù)3種因素，各設計3個水平，通過正交試驗來優(yōu)化超聲波輔助溶劑提取的最佳工藝條件。其正交因素水平及結果分析見表1、表2。

由表2可知，超聲波輔助提取花色苷的最佳工藝條件為時間8min、溫度40℃、乙醇體積分數(shù)65%，此時經超聲以后的溶液其吸光度達到最大值。比較分析影響花色苷提取的3個因素，它們的影響大小順序依次為乙醇體積分數(shù)＞溫度＞時間。

表1 正交因素水平表Table 1 Factors and levels

表2 正交試驗結果分析Table 2 Results of the orthogonal test

2.2 HSCCC溶劑系統(tǒng)的研究

在HSCCC 分離的過程中，選擇合適的溶劑系統(tǒng)是至關重要的。一般來說：合適的分配系數(shù)K 值應在0.5～2.0，并且各組分的分配系數(shù)值要有足夠大的差異［12］。目前分配系數(shù)的測定多采用薄層色譜法（TLC）、毛細管電泳法（CE）、高效液相色 譜 法（HPLC）及分析型HSCCC 法［13－16］。依 據(jù) 文獻［17～20］，本試驗采用正丁醇－甲基叔丁基醚－乙腈－水－三氟乙酸為溶劑系統(tǒng)，并用HPLC 法測定測定其K 值。試驗依據(jù)目標組分的K 值，對正丁醇－甲基叔丁基醚－乙腈－水－三氟乙酸這一溶劑體系的不同配比進行了比較篩選，其各溶劑配比及K 值見表3。

表3 不同溶劑體系配比的分配系數(shù)Table 3 Distribution coefficient（K）of compounds in solvent system with different proportions

試驗考察多種溶劑體系的HSCCC分離效果。由表3可知，在以上4個溶劑系統(tǒng)中，各組分的分配系數(shù)K 值大都在0.5～2.0，基本符合分配系數(shù)要求，但是在溶劑體系1、2、4中，由于K 值比較接近，導致3組分不能完全分離，而溶劑體系3中的K 值相差比較大，對三目標組分有較好的分離，綜合考慮實際分離效果和效率，最終選用溶劑體系3作為分離紫甘藍花色苷的HSCCC溶劑體系。

2.3 HSCCC分離純化的結果

按照1.2.3的方法，以正丁醇－甲基叔丁基醚－乙腈－水－三氟乙酸（2∶2∶1∶5∶0.01，V／V／V／V）為溶劑體系，分離出3 個組分，測得固定相保留率為56.6%。并且從300mg紫甘藍花色苷粗提樣中分離得到化合物Ⅰ（84mg），化合物Ⅱ（56mg），化合物Ⅲ（13mg）。HSCCC 分離圖譜見圖1。

由圖1可知，圖中有3個比較明顯的峰，分別在77，105，205min時出現(xiàn)，這表明紫甘藍花色苷提取樣經HSCCC 分離得到3種化合物，分別命名為組分Ⅰ，組分Ⅱ，組分Ⅲ。

2.4 紫外可見全掃描

花色苷在紫外區(qū)和可見光區(qū)的最大吸收波長分別為275nm和523nm 左右［21］，可以通過紫外可見掃描物質的最大波長來判定該物質是否為花色苷類物質。

將紫甘藍花色苷粗提樣和HSCCC 分離出來的3 個組分，分別用0.025mol／L 的氯化鉀溶液稀釋至一定濃度，用紫外可見分光光度儀進行紫外可見全掃描，結果見圖2。

圖1 紫甘藍花色苷的HSCCC分離圖譜Figure 1 HSCCC chromatogram of anthocyanins from purple cabbage

圖2 紫甘藍花色苷粗提物及HSCCC分離組分紫外可見全掃描圖譜Figure 2 Ultraviolet visible full scan of anthocyanins and three components from purple cabbage

由圖2可知，紫甘藍花色苷粗體樣和組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ在275nm 和523nm 附近都有最大吸收峰，所以可以確定3組分均為花色苷。

2.5 HPLC檢測的結果

用HPLC對紫甘藍花色苷粗提物和HSCCC 分離所得的3個組分進行純度檢測分析，結果見圖3和圖4。根據(jù)峰面積計算出組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的純度分別為76.28%，5.46%，91.46%，經過濃縮、凍干后其質量分別為84，56，13mg。

由圖3可知，花色苷粗提取經過HPLC檢測得到3個比較高的峰，結合3組分的HPLC圖譜，可以確認，它們依次為組分Ⅲ、組分Ⅱ、組分Ⅰ。

由圖4可知，3個組分經過HPLC檢測，都等達到了良好的分離效果，特別是組分Ⅲ，幾乎沒有雜質，純度達到了91.46%，組分Ⅰ、組分Ⅱ的純度分別為76.28%，45.46%。

圖3 紫甘藍花色苷粗提物的HPLC圖譜Figure 3 HPLC chromatogram of anthocyanins from red cabbage

圖4 紫甘藍花色苷3個組分的HPLC色譜圖Figure 4 HPLC chromatograms of three components

3 結論

采用超聲波溶劑輔助提取法提取紫甘藍花色苷，優(yōu)化出最佳工藝條件為提取時間8min、提取溫度40 ℃、乙醇體積分數(shù)65%。并利用HSCCC 色譜法從紫甘藍花色苷中分離得到得到3 種化合物，300 mg 紫甘藍花色苷提取物經過HSCCC分離后得到84 mg 純度為76.28%的化合物Ⅰ、56mg 純度為45.46%的化合物Ⅱ、13mg純度為91.46%的化合物Ⅲ，但要具體確定各個分離組分的結構，還需經過核磁共振等試驗來鑒定。

1 Hollman P C H，Hertog M G L，Katan M B.Analysis and health effects of flavonoids［J］.Food Chem.，1996（57）：43～46.

2 Sichel G，Corsaro C，Scalla M，et al.In vitro scavenger activity of some flavonoids and melanin against O2－［J］.Free Radical Biol.Med.，1991（11）：1～8.

3 Rice－Evans C，Miller N J，Paganga G.Structure－antioxidant activity relationships of flavonoids and phenolic acids［J］.Free Radical Biol.Med.，1996，20（7）：933～956.

4 于東，陳桂星.花色苷提取、分離純化及鑒定的研究進展［J］.食品發(fā)酵與工業(yè)，2009，35（3）：127～133.

5 李韜，張宏宇.花色苷類色素的研究進展［J］.農業(yè)科技與裝備，2010（5）：23～27.

6 伍方勇，戴德舜，王義明.高速逆流色譜與質譜聯(lián)用在中藥分析中的應用［J］.高等學校化學學報，2002，23（9）：1 698～1 700.

7 Sutherland I A.Recent progress on the industrial scale－up of counter－current chromatography［J］.Journal of Chromatography A，2007，1 151（1～2）：6～13.

8 高冷，謝冠.高速逆流色譜分離純化凍青中的黃酮類化合物［J］.化學與生物工程，2012，29（2）：73～75.

9 程悅，嚴志勇.高速逆流色譜分離制備苦茶中的苦茶堿［J］.中山大學學報（自然科學版），2010，49（3）：65～69.

10 郭麗麗，劉景圣.高速逆流色譜實驗在有效成分分離中溶劑體系的選擇［J］.農產品加工，2010（5）：27～29.

11 李艷，肖凱軍.高效逆流色譜研究進展－在天然產物有效成分分離方面的應用［J］.現(xiàn)代食品與藥品雜志，2006（4）：78～80.12 李佳銀，羅晉.高速逆流色譜法分離紫錐菊花色苷及其抗氧化性研究［J］.分析測試學報，2012，31（1）：45～50.

13 時新剛，陳志偉.高速逆流色譜應用研究進展［J］.生命科學儀器，2009（8）：3～5.

14 李玉蘭，張小燕.黃芩中總黃酮的提取及高速逆流色譜分離純化［J］.中藥新藥與臨床藥理，2010，21（4）：437～439.

15 Kamaljit Vilkhu，Raymond Mawson.Applications and opportunities for ultrasound assisted extraction in the food industry－A review［J］.Innovative Food Science and Emerging Technologies，2008（9）：161～169.

16 Ito Y A，Conway W D.High－speed counter－current chromatography［M］.New York：Wiely／Interscience，1996：36.

17 A Degenhardt，H Knapp，P Winterhalter.Separation and purification of anthocyanins by high－speed countercurrent chromatography and screening for antioxidant activity［J］.Agric Food Chem.，2000，48（2）：338～343.

18 Michael Schwarz，SiIke Hillebrand，Saskia Habben，et a1.Application of high－speed countercurrent chromatography to the large－scale isolation of anthocyanins［J］.Biochemical Engineering Journal，2003（14）：179～189.

19 Torskangerpol K，Chou E，Andersen O M.Separation of acylated anthocyanin pigments by high speed CCC［J］.Liq.Chrom.＆Rel.Technol.，2001，24（11＆12）：1 791～1 799.

20 Du Qizhen，Gerold Jerz，Peter Winterhalter.Isolation of two anthocyanins sambubiosides from bilberry（vaccinium myrtillus）by high－speed countercurrent chromatography［J］.Journal of Chromatography A，2004（1 045）：59～63.

21 孫建霞，張燕，孫志健，等.花色苷的資源分布以及定性定量分析方法研究進展［J］.食品科學，2009，30（5）：263～268.