茄子組織培養高效再生植株體系的優化

黃志銀，曹必好

（1.天津科潤蔬菜研究所，300384；2.華南農業大學園藝學院）

茄子組織培養高效再生植株體系的優化

黃志銀1，曹必好2

（1.天津科潤蔬菜研究所，300384；2.華南農業大學園藝學院）

以三月茄為試驗材料，探討了不同濃度6-BA、ZT與IAA對茄子外植體不定芽分化的影響，比較了下胚軸不同接種方式對不定芽分化的影響和不同生根培養基對茄子不定芽的生根效果。結果表明，MS＋IAA（0.2 mg/L）＋6-BA（2.0 mg/L）＋ZT（1.0 mg/L）能加強外植體不定芽的分化能力，帶柄子葉的不定芽分化率達到60.2%，下胚軸的不定芽分化率達到98.1%，類Flamingo-bill外植體的不定芽分化率更是達到了100%；與橫向平接相比，下胚軸正向扦插能提高不定芽的分化率和不定芽分化系數，還能提前分化；茄子不定芽在MS固體培養基上生根效果最好，生根率達到100%。

茄子；外植體；再生；分化系數

利用轉基因技術將外源目的基因導入茄子（Solanum melongenaL.），為茄子育種創造新的種質資源，是茄子分子育種的重要途徑之一。實現外源基因的成功轉化的前提是建立一個茄子高效再生體系。有關茄子離體再生的研究，在國內外有過一些報道，研究者從茄子的器官分化[1～7]、胚狀體誘導[8，9]、花藥培養[10]、小孢子培養[11，12]、原生質體培養[13～15]等方面進行了研究，不同研究者得到的結果不一樣。雖然取得了一些成就，但不定芽分化頻率還是不高，仍然不能滿足茄子遺傳轉化的要求。本文以三月茄為試材，探討了影響茄子離體培養的主要因素，以期建立適用于茄子遺傳轉化的高效再生體系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為三月茄，購自重慶市農業科學院重慶科光種苗有限公司。

1.2 試驗方法

①無菌苗的獲得 將三月茄種子經單蒸水浸泡1 h左右，并沖洗3～5次。在超凈工作臺上，用75%的酒精消毒0.5～1 min，接著用無菌水清洗2～3次，再用含2%有效氯的次氯酸鈉溶液浸泡消毒20 min，無菌水清洗2次后用適量無菌水浸泡種子5～8 min，最后用無菌水清洗2～3次后播種在含有0.7%瓊脂和3.0%蔗糖的1/2 MS固體培養基上。接種后在 （25±1）℃和16 h光照/8 h黑暗的條件下培養，2周左右得到待用的無菌苗。

②分化培養基配方 在加有0.8%瓊脂和3.0%蔗糖的MS培養基中，添加不同濃度的6-BA、IAA和玉米素（ZT），各種培養基配方見表1。

③外植體的制備及接種 將12～14 d苗齡的三月茄無菌苗，在超凈工作臺上切成3種類型的外植體（帶柄子葉、下胚軸、類Flamingo-bill——不含生長點的子葉帶下胚軸），帶柄子葉去掉部分葉尖造成傷口，下胚軸切成1 cm左右長的小段，類Flamingo-bill外植體的下胚軸保留1 cm左右長度，3種類型外植體分別接種在含有不同植物生長調節物質的分化培養基上。

帶柄子葉平放接種，類Flamingo-bill外植體采用3種扦插方式接種，一部分下胚軸以正向扦插的方式接種在分化培養基上，一部分下胚軸反向扦插接種，一部分下胚軸以平放的方式接種，每種外植體每個處理接種36個外植體，3次重復。接種后置于培養室，在（25±1）℃和16 h光照/8 h黑暗的光周期下培養，光強1 600～2 000 lx；每3 d觀察一次，記錄各類外植體的分化情況；每2周繼代一次，4周后分別統計不同接種方式的3種外植體的愈傷率、不定芽分化率和不定芽分化系數。愈傷率（%）=（愈傷數/接種的外植體總數）×100%；不定芽分化率（%）=（分化不定芽的外植體數/接種的外植體總數）× 100%；不定芽分化系數=分化的不定芽總數/分化的外植體總數。

表1 不同分化培養基配方

④不定芽生根及移栽 待分化的不定芽伸長至2～3 cm，長出2片以上真葉時，將其轉接到4種加有0.8%瓊脂和3.0%蔗糖的不同生根培養基[MS，MS＋IAA（0.1 mg/L），MS＋IAA（0.2 mg/L），MS＋NAA（1 mg/L）]上生根，待小植株根系發達后，進行馴化移栽。在人工氣候培養箱中將封口膜打開，煉苗3 d。然后取出小植株，小心洗凈根部培養基，移栽到土壤透氣性好的花盆中，并覆蓋塑料薄膜，每天對葉片噴霧3次，以保持濕度，待新葉長出后，去掉薄膜。將煉苗移栽到大田，2周后統計組培苗的移栽成活率。

2 結果與分析

2.1 不同生長調節物質對三月茄愈傷產生和不定芽分化的影響

從表2可以看出，6-BA對三月茄的不定芽分化效果較好，3種類型外植體的平均不定芽分化率達到40%以上，最高達到88.9%。但是在試驗中觀察到，當加入較高濃度6-BA后，外植體愈傷組織形成較多，一定程度上抑制了不定芽的分化和伸長；當加有低濃度的IAA后，不定芽的分化率明顯提高，平均達到了60%以上，最高達到100%。玉米素（ZT）對三月茄的不定芽分化效果也較理想，0.5～2 mg/L的ZT可使不定芽分化率平均達到70%以上，最高的達到100%。同樣玉米素濃度過高也會使外植體大量產生愈傷組織，不利于不定芽的分化。當把6-BA、IAA和ZT都加入培養基時（B17），不定芽的分化率明顯提高，平均可達86.1%，最高達到100%。 3種外植體均在培養基B17上的分化效果最好，下胚軸和類Flamingo-bill外植體的不定芽分化率及不定芽分化系數分別達到了98.1%、3.2和100%、1.8；對于帶柄子葉來說，不定芽分化率也達到了60.2%，但是其不定芽的分化系數不如在B5和B8上高，只有1.4。

表2 不同培養基對不同外植體類型不定芽分化的影響

2.2 不同類型外植體不定芽分化的比較

試驗中觀察到（表2），平放接種的下胚軸和帶柄子葉分化不定芽的方式為先脫分化產生愈傷組織，再從愈傷上分化出不定芽；扦插接種的下胚軸和類Flamingo-bill外植體主要從頂端的傷口處直接分化出不定芽，插入培養基的部分則產生愈傷組織，有的愈傷能分化出胚狀體，但難以形成正常的不定芽。帶柄子葉不如另外2種外植體的不定芽分化效果好，分化率顯著偏低。在試驗中比較了不同外植體的不定芽分化系數，下胚軸的不定芽分化系數比另外兩種外植體的高，大多數都可以分化出兩個以上的不定芽；而類Flamingo-bill外植體大多數都產生1個不定芽，帶柄子葉基本上也是從葉柄部位分化出1個不定芽。

2.3 不同接種方式對茄子下胚軸愈傷發生及不定芽分化的比較

試驗觀察到茄子下胚軸橫向平接不定芽分化效果不如正向扦插接好，不定芽分化系數也沒有正向扦插的高。如表3所示，以橫向平接的方式接種下胚軸的不定芽分化率只有43%，不定芽分化系數平均為1.8，而以正向扦插接種的分別達到98%和 2.6。試驗中發現橫向平接的下胚軸愈傷分化能力強，產生大量白色疏松愈傷，且發現橫向平接的下胚軸只在其植物學上端發生不定芽分化，其周圍的愈傷組織不能分化成芽，而正向扦插的下胚軸則從上端直接分化出不定芽，下端仍能分化愈傷組織，且愈傷組織較緊實，綠色芽點較多，比橫向平接的下胚軸容易分化出不定芽，分化時間也要早2 d左右。這表明，正向扦插接種能明顯提高不定芽的分化能力和使其提前分化。但是，在試驗中觀察到，如果反向扦插接種，則下胚軸只產生愈傷組織，基本沒有不定芽的分化。

2.4 不同生根培養基對不定芽生根的影響

如表4所示，不加任何植物生長調節物質的MS培養基對茄子的生根效果最好，生根率達100%，每個不定芽產生的主根數量平均達到4.6條，而且有許多側根，煉苗移栽全部成活；加有0.1，0.2 mg/L IAA的配方生根效果也較好，MS+IAA（0.1 mg/L）的配方生根率和移栽成活率都達到100%；當IAA濃度達到0.2 mg/L時，主根變得粗大，主根數量較少，組培苗移栽成活率也降低。試驗中觀察到當加有IAA或者NAA時不定芽的生根基部有愈傷產生，尤其是加有1 mg/L的NAA時不定芽基部產生大量的愈傷組織，不利于根的分化，分化的主根和側根都很少，不利于組培苗移栽成活。

3 結論與討論

6-BA和ZT是組織培養中廣泛應用的生長調節物質，尤其是6-BA在茄科植物[7，10]中應用有良好的效果，當6-BA難于誘導分化時，改用或者添加ZT有較好的效果；IAA則能促進細胞的伸長和分化。本研究在分化培養基B17上，將茄子下胚軸正向扦插接種，不定芽分化率達到98.1%，分化系數達到3.2，而橫向平接的下胚軸不定芽分化率只有43%，分化系數為1.8；類Flamingo-bill外植體的不定芽分化率可達到100%，帶柄子葉的達到60.2%。而同類研究報道當中，俞瓊等[5]得到的茄子子葉不定芽分化率最高為37.0%，下胚軸的最高為46%；余波瀾等[4]得到的最高茄子子葉和下胚軸不定芽分化率分別為37%和67%；張興國等[3]報道的三月茄下胚軸最高不定芽分化率也才達78.8%，這說明本研究得到的三月茄不定芽分化效果較好，主要原因為培養基配方差異和接種方式，因為同類報道都是將下胚軸平放接種在分化培養基上，先脫分化后再分化不定芽，而本研究則以茄子下胚軸正向扦插的方式接種，不定芽的發生大多數是直接從傷口處分化；并且與橫向平接相比，正向扦插接種除不定芽分化率高外，分化時間還可以提前2 d左右，不定芽的伸長也很容易。

表3 下胚軸不同接種方式對不定芽發生的比較

表4 不同配方生根培養基對三月茄生根效果的比較

本研究同樣觀察到不定芽呈極性分化的現象，結果和余波瀾等[4]的研究相似。不同的是，當下胚軸正向扦插接種時也能得到第3種類型[4]的愈傷組織，且能觀察到不定芽從愈傷組織上分化出來，但是大部分玻璃化，較難長成正常的不定芽。當下胚軸正向扦插接種時，如果植物學上端插入培養基，則植物學上端部分分化堅實的深綠色愈傷組織，難以形成不定芽，而其植物學下端則在空中產生一個白色泡狀愈傷，但愈傷不會瘋長，也不會分化芽，有的能觀察到根分化。這表明，茄子下胚軸分化不定芽存在極性分化現象，且正向扦插接種利于極性分化的表現，能明顯提高不定芽的分化能力和提前分化。本研究認為極性分化發生可能與子葉柄和下胚軸的近子葉端的分生活躍細胞容易脫分化和再分化有關[4]，還可能與植物激素的極性運輸有關，外植體自身產生的激素及其控制的濃度可能更利于不定芽的分化。我們得到的茄子高效再生體系是否具有通用性，還有待進一步的驗證。

[1]Kazumitsu M.Callus induction and plantletformatio through culture ofisolated microspores ofeggplant (Solanum melongenaL.)[J].Plant Cell Reports,1996,15: 391-395.

[2]吳耀武，馬彩萍.茄子（Solanum melongena）愈傷組織的產生與植株的再生[J].西北植物研究，1981（2）：52-54.

[3]張興國，劉元清，楊正安，等.茄子遺傳轉化體系的建立[J].西南農業大學學報，2001，23（3）：233-234.

[4]余波瀾，張利明，孫勇如，等.茄子子葉和下胚軸的組織培養和植株再生[J].植物生理學通訊，2003，39（4）：317-320.

[5]俞瓊，陳利，劉鵬，等.茄子組織培養再生體系研究初報[J].廣東農業科學，2007（2）：24-26.

[6]胡曉琴,賈士榮.水稻巰基蛋白酶抑制劑基因導入馬鈴薯和茄子[J].園藝學報，1998，25（1）：65-69.

[7]黎定軍，張寶璽，趙開軍，等.辣椒子葉高效植株再生體系的建立[J].園藝學報，2002，29（1）：25-29.

[8]Matsuoka H,Hinata K.NAA-induced organogenesis and embryo genesis in hypocotyl callus ofSolarium melongenaL.[J].J Exp Bot,1979,30:363-370.

[9]張蘭英,李耿光.兩種茄子子葉誘導胚狀體和植株再生[J].植物生理學通訊，1987（4）：56.

[10]顏敬昌.植物組織培養手冊[M].上海：上海科學技術出版社，1990：289-292.

[11]連勇，劉福中，陳鈺輝，等.茄子體細胞雜種游離小孢子培養獲得再生植株[J].園藝學報，2004，31（2）：233-235.

[12]馬欣.茄子游離小孢子培養及其形態發育學觀察[D].保定：河北農業大學，2006.

[13]Jia J F,Potrykus I.Mesophyll protoplasts from Solanum melongenavar.depressum bailey regenerate to fertile plants[J].Plant Cell Reports,1981,1:71-72.

[14]Saxena P K,Gill R,Rashid A,et al.Plantlet formation from isolated protoplasts ofSolanum melongenaL.[J].Protoplasma,1981,106:355-359.

[15]李耿光，張蘭英.茄子子葉原生質體再生植株[J].遺傳學報，1988，15（3）：181-184.

Optimization of Efficient Regeneration System of Eggplant in Vitro

HUANG Zhiyin1,CAO Bihao2
(1.Tianjin Kernel Vegetable Research Institute,300384;2.College of Horticulture,South China Agricultural University)

Taking the explants of Sanyueqie as materials,we studied the effects of different concentrations of 6-BA,ZT and IAA mixture on the differentiation of adventitious buds,compared the effects of different inoculated ways of hypocotyls on adventitious bud differentiation and rooting efficiency of different rooting medium on adventitious buds.The results showed that the medium[MS+IAA(0.2 mg/L)+6-BA(2.0 mg/L)+ZT(1.0 mg/L)]could improve the differentiation ability of adventitious buds,and the adventitious bud differentiation rates of cotyledons with petiole,hypocotyls and hypocotyls with a cotyledon were 60.2%,98.1%and 100%respectively.Compared to the parallel inoculation,the normal vertical inoculation was better,with both the bud differentiation rate and bud differentiation coefficient increased and the differentiation time reduced.The solid MS medium possessed the best rooting effect,with the rooting ratio of 100%.

Eggplant;Explant;Regeneration;Differentiation coefficient

10.3865/j.issn.1001-3547.2012.10.002

廣東省科技攻關項目（2007A020300009-4）；華南農業大學校長基金；天津市農業科學院院長基金

黃志銀（1982-），男，碩士，助研，從事不結球白菜（油菜）育種研究，電話：13512469223，E-mail：falcon_888@163.com

曹必好，通信作者，電話：020-85280028，E-mail：caobh01@163.com

2012-03-13