美味黑粉菌冬孢子萌發條件的研究

徐蟬，張敬澤，王曉清，王志丹，郭得平

（浙江大學農業與生物技術學院，杭州，310058）

美味黑粉菌冬孢子萌發條件的研究

徐蟬，張敬澤，王曉清，王志丹，郭得平

（浙江大學農業與生物技術學院，杭州，310058）

研究了疏親水界面、溫度、pH值和不同物質對美味黑粉菌冬孢子萌發的影響，以探討美味黑粉菌冬孢子在自然生境條件萌發的適應性。研究結果表明，疏水界面促進美味黑粉菌冬孢子萌發，在疏水的聚苯乙烯塑料培養皿和茭白莖表皮上，萌發率高；冬孢子萌發的最適溫度為27～30℃，溫度過高或過低均抑制萌發；酸性條件促進冬孢子萌發，最適pH值為3～4；蔗糖促進冬孢子萌發，且以1%濃度最適，但同樣濃度的甘露醇、葡萄糖、海藻糖、D-果糖等抑制冬孢子萌發。

美味黑粉菌；冬孢子；萌發率

美味黑粉菌（Ustilago esculenta）是黑粉菌目、黑粉菌科、黑粉菌屬真菌，原發生于我國，在我國臺灣、越南、日本等東南亞國家和地區有分布。美味黑粉菌能侵染茭白（Zizania latifolia）并誘導其莖膨大，茭白以其膨大莖供食，是我國重要的水生蔬菜。通常，美味黑粉菌在茭白組織中以菌絲體的形式存在，但有時其會產生大量的冬孢子[1]。

大量試驗表明，美味黑粉菌在寄主植物茭白體內以菌絲體形式完成整個生活史。冬孢子作為接種源，其作用還未被試驗證實[2]。而依據黑粉菌屬特性，幾乎所有黑粉菌都具有二態型，冬孢子萌發產生單倍體的擔孢子，擔孢子像腐生的酵母一樣生長但對寄主沒有侵入性。當2個單倍體細胞融合后，產生的雙核絲狀體能侵染寄主植物，導致黑粉病的發生[3，4]。研究美味黑粉菌冬孢子萌發特性，是了解其生活史和侵染機制的基礎。前人對菰黑粉菌冬孢子的萌發情況進行了觀察和研究[5~7]，但冬孢子萌發對自然生境的確切需求還不很明了，因此，本文通過模擬影響冬孢子萌發的因素，進一步探討美味黑粉菌冬孢子萌發對環境條件的要求，為研究冬孢子在真菌生活史中的作用提供依據。

1 材料與方法

1.1 真菌材料

美味黑粉菌成熟冬孢子取自2010年浙江省德清縣梭子茭品種的灰茭植株上。灰茭存在室內半年后，取中部的冬孢子制備孢子懸浮液。

1.2 試驗方法

①孢子懸浮液的配制 取灰茭橫切面中部少量孢子，接于含有滅菌水的1.5 mL Eppendorf離心管中，振蕩混勻，配制每1 mL含1×106個孢子的懸浮液。

②疏親水界面對冬孢子萌發的影響 用移液槍取孢子懸浮液，分別接入聚苯乙烯塑料培養皿（直徑6 cm）、滅菌載玻片、含有水瓊脂培養基的表面和茭白莖皮條表面，標記接菌點位。每培養皿、載玻片、水瓊脂培養基和茭白莖皮條表面都含有3個孢子懸浮液液滴，然后放置到含有2層濕潤濾紙的密封容器中，于25℃培養箱中培養。每個試驗重復3次。48 h后鏡檢，觀察記錄冬孢子萌發情況，統計萌發率。孢子萌發率（%）=[孢子萌發數/（孢子萌發數+未萌發孢子數）]×100%。

③不同溫度對冬孢子萌發的影響 用移液槍取孢子懸浮液，接種于聚苯乙烯塑料培養皿（直徑6 cm）中，每皿含有3個孢子懸浮液液滴。分別置于15，18，21，24，27，30，33，36℃培養箱中培養。每個試驗重復3次。44 h后鏡檢，觀察和統計孢子的萌發率。

④不同pH值對冬孢子萌發的影響 制備pH值為 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11的冬孢子懸浮液（濃度為1×106個/mL孢子），接種于聚苯乙烯塑料培養皿（直徑6 cm）中，每皿含有3個孢子懸浮液液滴。置于28℃培養箱中培養。每個試驗重復3次。36 h后鏡檢，觀察和統計萌發率。

⑤不同營養物對冬孢子萌發的影響 制備冬孢子懸浮液（1×106個/mL孢子），其中懸浮液分別含有蔗糖（1%）、甘露醇（1%）、氯化鈉（1%）、葡萄糖（1%）、海藻糖（1%）和D-果糖（1%）。將所有冬孢子懸浮液的pH值調為4，接種于聚苯乙烯塑料培養皿（直徑6 cm）中，每皿含有3個孢子懸浮液液滴。置于28℃培養箱中培養。每個試驗重復3次。18 h后鏡檢，觀察和統計萌發率。

⑥蔗糖濃度對孢子萌發的影響 制備冬孢子懸浮液（1×106個/mL孢子），使其蔗糖濃度分別為0.0%，0.1%，0.5%，1.0%，2.0%，3.0%，4.0%，5.0%。將所有冬孢子懸浮液的pH值調為4，接種于聚苯乙烯塑料培養皿（直徑6 cm）中，每皿含有3個孢子懸浮液液滴，置于28℃培養箱中培養。12 h后鏡檢，觀察和統計萌發率。

2 結果與分析

2.1 疏親水界面對冬孢子萌發的影響

表1結果顯示，冬孢子在茭白莖皮條表面萌發率最高，約為32%，其次是在聚苯乙烯塑料培養皿，約為31%，但兩者沒有顯著差異（P<0.05）；再次是在載玻片，約為17%，在水瓊脂表面最低，僅為4%。結果表明，冬孢子在不同疏親水界面上萌發率差異是顯著的，揭示了冬孢子萌發受接觸硬度和疏親水界面的誘導。

2.2 不同溫度對冬孢子萌發的影響

表2結果顯示，美味黑粉菌冬孢子萌發溫度范圍在15~33℃，但低溫和高溫影響冬孢子萌發率。低于21℃，各處理間冬孢子萌發率沒有顯著差異（P< 0.05）；但高于21℃后，不同溫度間差異顯著；當溫度達到36℃時沒有孢子萌發。美味黑粉菌冬孢子最適萌發溫度為28℃左右。

2.3 不同pH值對冬孢子萌發的影響

圖1結果顯示，冬孢子在較大的pH值范圍內都能萌發，酸堿都能影響冬孢子萌發率，但酸性條件更顯著。但當pH值在7左右時，冬孢子幾乎不萌發，因而，冬孢子萌發率呈現雙峰。當pH值在1~7范圍內，冬孢子萌發率呈正態分布，當pH值在3左右時，冬孢子萌發率達到最高，約為95%。

表1 不同培養界面對冬孢子萌發的影響

表2 不同培養溫度對冬孢子萌發的影響

圖1 不同pH值對冬孢子萌發的影響

2.4 不同營養物對冬孢子萌發的影響

表3結果顯示，不同物質對黑粉菌冬孢子萌發影響較大，蔗糖能顯著的促進冬孢子萌發，而經甘露醇、氯化鈉、葡萄糖、海藻糖和D-果糖處理的冬孢子萌發率均顯著低于對照，對孢子萌發有顯著抑制作用。其中，D-果糖抑制效果最顯著，其次是海藻糖和葡萄糖，兩者之間沒有顯著差異；最后是氯化鈉和甘露醇，兩者之間沒有顯著差異。

2.5 蔗糖濃度對冬孢子萌發的影響

圖2結果顯示，冬孢子在蔗糖濃度為0%~5.0%時均可萌發，蔗糖顯著地促進冬孢子萌發，且當蔗糖濃度達到1.0%時，冬孢子萌發率最高，顯著高于其他處理濃度（P<0.05）。同時，結果也顯示，低濃度和高濃度的蔗糖溶液能抑制冬孢子萌發。

3 結論與討論

孢子萌發標志著真菌從休眠狀態到活性發育的轉變，其在真菌生活史中是一個關鍵階段。真菌已經演化出了確保孢子對專門適合生長條件信號反應的機制。在大多數情況下，糖是真菌孢子萌發所必須的，應保證其需要[8]。除此之外，植物基質或信號也誘導其萌發，如固體疏水表面或表皮蠟質[9]，而且孢子依據激活信號演化出不同萌發類型[10，11]。本試驗發現，美味黑粉菌冬孢子在疏水和硬的聚苯乙烯塑料和茭白莖表皮表面具有較高的萌發率，在較親水和硬的載玻片上萌發率較低，而在親水和軟的水瓊脂培養基表面上萌發率最低。這些結果證明美味黑粉菌冬孢子萌發受疏水性和硬的表面的誘導，也表明黑粉菌冬孢子傾向于在靠近茭白植株根莖部表皮處萌發生長，這可能利于黑粉菌對茭白植株的侵染。有些真菌孢子萌發需要宿主的存在[12]，但美味黑粉菌冬孢子在塑料培養皿和玻璃板上都能直接萌發。

本試驗中，美味黑粉菌冬孢子在溫度為27~ 30℃時萌發率達到最高，與以前報道相似[6]。本試驗結果表明，美味黑粉菌冬孢子萌發溫度稍高于一般真菌孢子25℃左右的萌發適溫。pH值對美味黑粉菌冬孢子萌發的影響較大，在本試驗模仿的自然生境條件下，冬孢子萌發的最適pH值為3~4，但當pH值降低到2時，能明顯觀察到其芽管呈短縮狀，甚至其后產生的擔孢子也為短縮狀，可見pH值太低不利于孢子生長；而在pH為中性時，冬孢子幾乎未萌發，與前人報道的美味黑粉菌冬孢子萌發的最適pH值為6[5，6]、玉米絲黑穂病病原菌冬孢子萌發最適pH值為7的研究結果有很大差異[12]，其原因可能是pH值對冬孢子萌發的影響與萌發基質有關，以前研究所用基質為營養培養基[5，6]，而本試驗所用萌發基質為水。

蔗糖、葡萄糖、甘露醇等碳源有利于冬孢子萌發[13]，也有報道認為生理鹽水也可促進孢子萌發[14]，其中葡萄糖常被用作促進多種真菌孢子萌發的營養液[15]。但我們的試驗結果顯示，甘露醇、葡萄糖、海藻糖、D-果糖和氯化鈉對美味黑粉菌冬孢子萌發有一定的抑制作用，而1.0%的蔗糖溶液對美味黑粉菌冬孢子萌發卻有顯著促進作用，是冬孢子發育最有效的糖[2，5，6]。這可能與寄主協同進化密切相關，在寄主體內，葉片產生的糖主要以蔗糖的形式從葉片向其他組織運輸，寄主體內的真菌菌絲獲得的營養可能主要是蔗糖。因此，本研究結果為了解美味黑粉菌冬孢子在田間自然環境條件下的行為和作用提供了重要信息。

表3 不同刺激物對冬孢子萌發的影響

圖2 蔗糖濃度對冬孢子萌發的影響

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Research on Factors Influencing Teliospore Germination ofUstilago esculenta

XU Chan,ZHANG Jingze,WANG Xiaoqing,WANG Zhidan,GUO Deping
(College of Agriculture and Biotechnology,Zhejiang University,Hangzhou 310058)

We investigated the factors influencing teliospore germination ofUstilago esculenta,such as surface characters, temperature,pH value and stimulants.The results showed that hydrophobic surfaces promoted the germination of teliospore,and the germination rates were higher on the hydrophobic polyethylene Petri dishes and surfaces of stem epidermis ofZizania latifolia.The highest germination rate occurred at 27 to 30℃,whereas it was inhibited by higher or lower temperature.The acidic condition promoted the germination of teliospore,with the optimum pH value of 3 to 4,and sucrose with the concentration of 1%was best fit for the germination of teliospore,but other carbon sources,such as mannitol,glucose,trehalose,D-fructose,inhibited teliospore germination.

Ustilago esculenta;Teliospore;Germination rate

10.3865/j.issn.1001-3547.2012.16.038

公益性行業（農業）科研專項經費項目“水生蔬菜產業技術體系研究與示范”（編號200903017-03）徐蟬（1986-），女，碩士，主要從事園藝學研究，電話：0571-88982796，E-mail：xchan8808@163.com郭得平，通信作者，E-mail：dpguo@zju.edu.cn

2012-06-28