Ang-2和HIF-1α在膀胱移行細胞癌中的表達及臨床意義

李啟虎 王學華

1.四川省長寧縣中醫院，四川長寧 644300；2.四川省宜賓市第一人民醫院泌尿外科，四川宜賓 644000

近年來，我國泌尿科臨床最常見的腫瘤是膀胱腫瘤。其中，有約90%的膀胱惡行腫瘤是膀胱移行細胞癌[1]。國內外近期的研究證實供應腫瘤的營養物質依賴于腫瘤血管，影響腫瘤的生長、浸潤和轉移。近年來研究的重點和熱點主要圍繞和側重于腫瘤血管的形成機制及抗腫瘤血管形成兩方面[2-3]。

本實驗通過探討血管生成素-2（Ang-2）和缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）在膀胱移行細胞癌中的表達及其與膀胱移行細胞癌病理分級、臨床分期之間表達和相互關系，對實驗數據進行統計學處理，探討兩者在膀胱移行細胞癌中表達的相互關系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選取經60例膀胱移行細胞癌患者，均經臨床病理診斷確診，男51例，女9例，年齡33～81歲，平均（60.1±3.6）歲。所有試驗樣本均經過手術切除，石蠟包埋細胞癌標本并存檔。其中，進行尿道膀胱腫瘤電切33例，膀胱部分切除17例，根治性全膀胱切除10例。20例患者取前列腺摘除術切除的多余正常膀胱黏膜。對實驗樣本編號并做連續切片，每個樣本切片厚度4 cm，每個樣品切5片，一張用作HE染色，一張用作陰性對照，兩張用于Ang-2和HIF-1α的檢測，剩余一張備用。各實驗樣本切片經常規常規HE染色后進行組織學觀察。病理分級根據WHO標準進行分為三級，Ⅰ級21例，Ⅱ級22例，Ⅲ級17例；臨床分期按UICC分期標準[4]，淺表型（Tis-T1期）43例，Ta 5例，T1 38例；17例浸潤型（T2-T4期），T2 11例，T3 5例，T4 1例。

1.2 實驗步驟與試劑

將石蠟切片脫蠟至水，按照試劑盒說明書采用免疫組化染色S-P法測定，Ang-2和 HIF-1α一抗工作濃度均為1∶100，最后脫水，透明，中性樹膠封固，顯微鏡觀察。Ang-2陽性結果顯微觀察中，400倍的高倍鏡下選擇4個強免疫反應視野觀察并計數腫瘤細胞，計數量≥800個。HIF-1α陽性結果顯微觀察中，高倍鏡下隨機抽取5個視野對腫瘤細胞觀察，并計數。計數量200個。

一抗：Ang-2（武漢博士德生物工程有限公司，BA1530）；HIF-1α多克隆兔抗人抗體（武漢博士德生物工程有限公司，BA0912）；即用型超敏S-P試劑盒（鼠兔通用型）（福州邁新生物技術有限公司產品，KIT-9710），DAB（福州邁新生物技術有限公司產品，DAB-0031）；檸檬酸抗原修復緩沖液（福州邁新生物技術有限公司產品，MVS-0066）。

1.3 結果判斷標準

1.3.1 Ang-2陽性結果判斷標準 細胞漿和胞膜中分布著以棕黃色顆粒狀或線網狀為主的Ang-2陽性染色體，結果判斷參照文獻[4]。根據細胞的染色程度和比率將計數細胞分為4個級別：無陽性細胞為陰性（-）；20%陽性細胞并微弱染色為弱陽性（+）；20%～50%陽性細胞并中度染色為中度陽性（++）；＞50%陽性細胞并強染色為強陽性（+++）。陽性表達判定：中度陽性（++）和強陽性（+++），陰性表達判定：陰性（-）和弱陽性（+）。見圖1。

1.3.2 HIF-1α陽性結果判斷標準 細胞核和（或）胞漿中分布著以棕黃色顆粒狀為主的HIF-1α陽性染色體。結果判斷參照文獻[5]。按細胞染色強度和比率分為5個級別：（-）腫瘤細胞無著色；（±）＜10%的細胞染色；（+）11%～25%的細胞染色；（++）26%～50%的細胞染色；（+++）51%的細胞染色。陽性表達判定：中度陽性（++）和強陽性（+++），陰性表達判定：陰性（-）和弱陽性（+）。見圖2。

圖1 TCCⅡ級組織中Ang-2（+），陽性物質位于腫瘤細胞胞漿胞膜，呈棕黃色（SP×400）

圖2 TCCⅡ級組織中HIF-1α（+），陽性物質主要位于腫瘤細胞核，呈棕黃色（SP×400）

1.4 統計學處理

采用SPSS13.0統計軟件對實驗結果數據進行處理分析,計數資料采用x2檢驗和Spear-man等級相關分析檢驗。檢驗水準α=0.05，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Ang-2陽性表達與膀胱移行細胞癌病理分級的關系

本研究中Ang-2和HIF-1α在正常膀胱組織中無表達，但在膀胱移行細胞癌標本均有表達，Ang-2和HIF-1α在膀胱移行細胞癌中的陽性表達率分別為47.7%（28/60）、41.7%（25/60）。Ang-2和HIF-1α在膀胱移行細胞癌中陽性表達率隨其病理分級和臨床分期增加而升高。見表1。

表1 Ang-2陽性表達與膀胱移行細胞癌病理分級的關系

2.2 Ang-2陽性表達與膀胱移行細胞癌臨床分期的關系

Ang-2陽性表達率和染色強度與臨床分期成正比關系，各期的陽性率經統計學x2檢驗，差異有統計學意義（P=0.001＜0.05）。見表2。

表2 Ang-2陽性表達與膀胱移行細胞癌臨床分期的關系

2.3 HIF-1α陽性表達與膀胱移行細胞癌病理分級的關系

HIF-1α陽性率在膀胱移行細胞癌陽性率逐步升高，表明HIF-1α陽性表達率和染色強度與病理分級成正比關系。見表3。

2.4 HIF-1α陽性表達與膀胱移行細胞癌臨床分期的關系

試驗中Tis-T1期與T2-T4期的陽性率分別為23.3%、73.7%，兩期的陽性率經統計學x2檢驗，差異有統計學意義（P=0.001＜0.05），HIF-1α陽性率越高膀胱移行細胞癌的浸潤越深。見表4。

表3 HIF-1α陽性表達與膀胱移行細胞癌病理分級的關系

表4 HIF-1α陽性表達與膀胱移行細胞癌臨床分期的關系

2.5 Ang-2、HIF-1α在膀胱移行細胞癌中的表達情況

經統計檢驗，Ang-2與HIF-1α的等級相關系數rs為0.498，P＜0.05，差異有統計學意義。見表5。

表5 Ang-2、HIF-1α在膀胱移行細胞癌中的表達情況

3 討論

有研究認為，正常的膀胱組織中血管穩定，呈靜息狀態，而腫瘤血管的形成受膀胱移行細胞癌的腫瘤血管不穩定的誘導，而這種不穩定與Ang-2有關[5]，通過抑制Ang-1與Tie2結合使得自身可以與Tie2受體結合。膀胱移行細胞癌浸潤的深淺度與Ang-2陽性率有關，陽性率越高浸潤越深，表示預后越差，這點在本次通過研究中被證實，Ang-2陽性率在膀胱移行細胞癌G1、G2、G3級中分別為28.6%、54.5%、64.7%，陽性率逐步升高，表明Ang-2陽性表達率和染色強度與病理分級成正比關系，Tis-T1期與T2-T4期的陽性率分別為32.6%、82.4%，兩期的陽性率經統計學x2檢驗， P＜0.05，差異有統計學意義（P=0.001），表明陽性率越高膀胱移行細胞癌的浸潤越深。Ang-2參與膀胱移行細胞癌的發生、發展過程，可能通過調節腫瘤血管形成來完成。癌變過程中膀胱組織獲得了Ang-2，試驗中強陽性染色多分布在高分級（G3）和高分期（≥T2）腫瘤的癌細胞中，另外部分切片可在腫瘤微血管內皮上發現有陽性表達。

有研究表明，HIF-1α在膀胱移行細胞癌中過表達可上調VEGF,日本研究表明，有學者通過建立HIF-1α過表達膀胱移行細胞癌細胞株（EJ-HIF1[alpha] cells）并對其研究后發現，過HIF-1α的過表達加速細胞增殖生長[6-7]。HIF-1α過表達參與膀胱移行細胞癌血管的形成[8-9]，Kondo等[9]研究表明，HIF-1α陽性率與膀胱腫瘤組織中微血管計數（microvessel count，MVC）正相關。本研究通過對HIF-1α與膀胱移行細胞癌臨床病理特征兩者之間關系進行分析，HIF-1α過表達可能通過提高腫瘤血管形成而促進膀胱移行細胞癌的生長，HIF-1α陽性率在膀胱移行細胞癌G1、G2、 G3級中分別為23.8%、40.9%、64.7%，陽性率逐步升高，表明HIF-1α陽性表達率和染色強度與病理分級成正比關系，本研究中G1與G3陽性率相比較，經x2檢驗，差異有統計學意義（P=0.016＜0.05）也證實這一結論。試驗中Tis-T1期與T2-T4期的陽性率分別為23.3%、73.7%，兩期的陽性率經統計學x2檢驗，差異有統計學意義（P=0.001＜0.05），HIF-1α陽性率越高膀胱移行細胞癌的浸潤越深。本研究結果表明，膀胱移行細胞癌的惡性程度及浸潤程度與HIF-1α有關，其陽性表達率、染色強度與病理分級和臨床分期成比例關系。在整個癌變過程中膀胱組織有基因突變發生，還發現在腫瘤血管上皮細胞核上有許多標本切片中的HIF-1α呈現強染色并參與膀胱移行細胞癌的缺氧調節。

本實驗通過探討血管生成素-2和缺氧誘導因子-1α在膀胱移行細胞癌中的表達及其與膀胱移行細胞癌病理分級、臨床分期之間表達和相互關系，有研究認為Ang-2和 HIF-1α的陽性率表達之間有正向相關，統計學分析實驗的研究結果表明，Ang-2和HIF-1α在膀胱移行細胞癌中表達，rs（Ang-2，HIF-1α）=0.498，P＜0.05，差異有統計學意義，其在缺氧這一始動因素作用下相互協同調節VEGF并相互影響，且呈現兩兩相關的特殊關系，共同參與膀胱移行細胞癌的腫瘤血管形成，進而影響膀胱移行細胞癌的生物學行為。目前尚不清楚其具體作用機制，需要科學工作者及臨床醫務者們共同繼續研究。

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