原發性肝癌患者外周血CD105陽性細胞的測定及其意義

陳霞 劉蕾 牛國超 梁育飛 張曉嵐

肝硬化被視為原發性肝癌(HCC)的一種癌前疾病。肝癌的篩查方法包括血清甲胎蛋白(AFP)檢測、B超及放射學檢查等，但是AFP檢測對肝癌診斷的陽性率差別很大。CD105是一種增生相關內皮細胞的細胞膜抗原。CD105參與了血管生成的某些過程，因此可以將CD105作為腫瘤新生血管標記物。CD105參與血管生成，是新生血管的標志，因此，可以預見CD105在惡性腫瘤的診斷、治療和預后中發揮重要的作用。HCC患者外周血CD105陽性細胞的測定及在預測HCC的價值筆者尚未見報道。本研究通過檢測外周血CD105陽性細胞和血清AFP在肝硬化及HCC患者的表達水平，探討HCC患者與肝硬化患者及正常對照間外周血CD105陽性細胞表達的差異及其意義，判定CD105在肝硬化肝癌早期診斷中的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 納入標準:①肝硬化病例均符合2000年9月西安中華醫學會傳染病與寄生蟲病學會分會、肝炎后肝硬化診斷標準;②HCC患者符合2001年9月第八屆全國肝癌學術會議通過的原發性肝癌的臨床診斷與分期標準;③臨床資料齊全，包括肝功能、凝血常規檢測，B超或CT影像學檢查。

1.1.2 排除標準:①合并其他部位腫瘤;②風濕免疫性疾?。?］;③妊娠女性;④心肌梗死急性期［1］。

1.1.3 病例資料 選取滄州市中心醫院住院肝硬化患者60例為肝硬化組，男44例，女16例;平均年齡(55±12)歲。HCC患者40例為HCC組，男30例，女10例;平均年齡(54±8)歲。另外，選取健康志愿者30例作為正常對照組，男14例，女16例;平均年齡(59±10)歲。

1.2 方法

1.2.1 標本采集:清晨空腹抽血后，樣本分送CD105和AFP檢測。

1.2.2 CD105 測定:抽取抗凝靜脈全血 1 ml，取其中 100 μl全血置于一試管中，加入 20 μlγ1 對照液，后加入 20 μl CD45;另取一試管 100 μl全血，加入 20 μl CD105，再加入 20 μl CD45，隨后2管避光放置20 min，各加入溶血素1 ml，再避光放置10 min，以1500 r/min的速度離心5 min，棄上清液，各加緩沖液2 ml，同一速度再次離心5 min，棄上清液，再加入400 μl緩沖液后上機，用流式細胞儀檢測，以Cell Quest軟件獲取分析數據，定量分析每管樣品中10 000個細胞，以CD105+細胞為陽性細胞，收集數據，計數陽性細胞的數目，判定結果。檢測外周血中CD105陽性細胞的表達率。

1.2.3 AFP測定:采用微粒子捕捉免疫發光技術(MEIA)，酶標抗體采用堿性磷酸酶(ALP)作為標記物，取血清的上清液1 ml，置于測量杯中，儀器自動吸取樣品 50 μl，液相試劑250 μl，固相試劑 250 μl，37℃ 溫水浴 7.5 min，沖洗后，自動加入反應試劑(堿性雙氧水)，激發反應，其發光強度與樣品濃度成正比。直接讀取結果。

1.3 統計學分析應用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以表示，多組間均數差異性比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)及q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HCC患者外周血CD105陽性細胞變化 HCC組外周血CD105陽性細胞水平高于肝硬化組與正常對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)。肝硬化組外周血CD105陽性細胞水平高于正常對照組，但差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 3組CD105陽性細胞的表達%，±s

表1 3組CD105陽性細胞的表達%，±s

注:與HCC 組比較，*P ＜0.05

?

2.2 HCC患者外周血CD105陽性細胞的測定與血清AFP水平比較 HCC患者的血清AFP的表達水平較肝硬化組和正常對照組升高，差異有統計學意義(P＜0.01)。其中AFP＞400 ng/ml的HCC患者外周血CD105陽性細胞水平顯著高于AFP＜400 ng/ml者，差異有統計學意義(P＜0.01)。見表2、3。

表2 3組血清AFP的表達ng/ml，±s

表2 3組血清AFP的表達ng/ml，±s

注:與HCC 組比較，*P ＜0.01

?

表3 不同AFP等級的肝癌中CD105陽性細胞比例與肝硬化的比較%，±s

表3 不同AFP等級的肝癌中CD105陽性細胞比例與肝硬化的比較%，±s

注:與HCC AFP＜400 ng/ml組比較，*P ＜0.01;與肝硬化組比較，#P ＜0.05，△P ＜0.01

?

2.3 HCC患者外周血CD105陽性細胞的水平與腫瘤大小的關系 腫瘤直徑＞5 cm的患者外周血CD105陽性細胞水平高于腫瘤直徑≤5 cm患者，差異有統計學意義(P＜0.01)。見表4。

表4 不同等級直徑肝癌CD105陽性細胞的表達比例%，±s

表4 不同等級直徑肝癌CD105陽性細胞的表達比例%，±s

注:與直徑≤5 cm比較，*P ＜0.01

?

3 討論

HCC是一種發病率及病死率均很高的惡性腫瘤。早期診斷、早期治療才能延長肝癌患者的生存期，肝癌缺乏特異的臨床表現，早期診斷率低，許多患者診斷時已發展為進展期肝癌。目前臨床上常用的肝癌早期篩查手段是AFP檢測、B超和影像學檢查等。AFP是目前診斷肝癌最常用的血清學指標，AFP的特異性較高，但敏感性不高，因此，尋找一個敏感性更高的血清診斷學指標對提高早期診斷率有一定幫助。

CD105是血管內皮細胞上可以結合轉化生長因子-β(TGF-β)的受體蛋白，是由2個相對分子質量約為9.5萬的單體聚合而成。有學者［2］發現了主要定位于各組織血管內皮細胞的endoglin，并且在眾多正常組織間質的血管內皮細胞和體外培養的血管內皮細胞上檢測到CD105。近幾年檢測腫瘤組織中新生血管內皮表面的TGF-β受體，使得CD105與腫瘤的生長和預后密切相關。CD105的存在，為提純內皮細胞或為來源于內皮細胞的腫瘤分類提供了一個可能有效的方法［3］。

CD105能調節內皮-間質間的信號傳遞，參與血管新生過程，而血管新生是腫瘤普遍存在的特征，與腫瘤組織的浸潤、轉移密切相關。在不同組織來源的惡性腫瘤中，CD105在腫瘤組織及其周圍血管的內皮細胞中高表達［4］，且CD105主要在未成熟的血管內皮表達，少數情況下可在腫瘤細胞中弱表達［5］，進一步的研究表明，Endoglin無論在體內和體外都過表達新生的血管內皮細胞，并與增殖指標cyclin A、ki-67過表達直接相關，是血管內皮細胞增殖的標志，與內皮細胞標志物如CD31、CD34、Ⅷ因子相關抗原等相比，CD105陽性細胞僅在新生的血管內皮細胞上高表達，而在正常組織的血管上無表達或弱表達［6，7］。

肝癌是一種富含血管的腫瘤，血管形成是肝癌生長、浸潤與轉移的重要條件。Takahashi等［8］發現，直腸癌、乳腺癌等發生轉移的患者血清S-CD105的表達水平顯著高于未發生轉移的患者，并發現化療能降低血清S-CD105的含量，從而提出血清S-CD105作為血管生成的標志，可以用來預測惡性腫瘤患者疾病復發、轉移的危險性。Akagi等［9］研究發現，在結直腸腺瘤由輕度、重度不典型增生至腺癌發展的過程中，CD105標記的MVD值逐漸升高，表明CD105在預測結直腸腺瘤癌變的過程中是有效指標，提示CD105有助于早期診斷疾病，及時治療。

盡管存在著一定程度的假陽性及假陰性，AFP仍然是目前公認的肝癌最佳診斷標志物，在HCC早期診斷中具有重要價值。AFP是胚胎干細胞產生的一種特殊蛋白質，胎兒出生后不久即逐漸消失，是目前應用最廣泛的早期診斷和篩查肝癌的指標，但其敏感性和特異性均存在不如意地方，尤其是血清中AFP水平與腫瘤大小呈正相關，對小腫瘤不敏感，限制了其在肝癌早期診斷中的價值［10］。于興等［11］報道，有27.7%的良性肝病患者血清AFP水平升高。

在乙型肝炎——肝硬化——肝癌的發展過程中，乙肝病毒通過整合到宿主的DNA中，促進血管生成。在惡性腫瘤形成中，TGF-β主要起到了促增殖作用。CD105通過激活TGF-β/ALK1信號傳導途徑，同時間接抑制TGF-β/ALK5信號傳導途徑，促進血管內皮細胞增殖，導致腫瘤血管生成。在腫瘤缺血缺氧時，內皮細胞開始裂解血管內皮細胞細胞膜上的CD105，釋放可溶性CD105，使原有腫瘤部位的血管內皮受損，內皮細胞間的連接松散、擴大，可使腫瘤細胞更好的釋放入血，進而遠處轉移。本研究發現HCC患者外周血CD105陽性細胞的水平顯著高于肝硬化組及正常對照組，考慮與以下因素有關:(1)肝癌患者TGFβ1過度調節及CD105在有活性的肝臟星狀細胞表達;(2)CD105在內皮細胞中過表達，而內皮細胞在腫瘤發生發展過程中至關重要，起著決定性作用。

AFP是由胚胎期卵黃囊和肝細胞產生的糖蛋白。肝癌患者體內AFP基因重新表達，其表達的調控主要發生于轉錄水平。大多數肝癌患者血清AFP顯著升高，但仍有10% ～30%的患者呈陰性。AFP必須聯合影像學才能診斷肝癌，但是AFP聯合影像學診斷也仍有一定的漏診率。本研究發現HCC患者外周血CD105陽性細胞的表達顯著高于肝硬化患者;AFP＞400 ng/ml的肝癌患者外周血CD105陽性細胞的表達水平顯著高于 AFP＜400 ng/ml者;AFP＜400 ng/ml的患者外周血CD105陽性細胞的表達顯著高于肝硬化組，提示CD105可能作為AFP不滿足診斷標準的肝癌患者補充診斷指標。

本研究發現外周血CD105在肝硬化進展為肝癌過程中的關系緊密，這也從側面反映了血管生成在肝癌發生發展過程中的重要性。我們通過分析發現外周血CD105陽性細胞和AFP聯合檢測可提高肝癌的陽性檢出率，減少漏診率，提高診斷的準確性。

惡性腫瘤的生長依賴于營養血管的不斷生成。一旦腫瘤直徑超過2 mm，就有毛細血管的生成，使腫瘤獲得足夠的血供和營養。腫瘤新生血管結構缺乏完整性，管壁薄弱，更容易被腫瘤細胞穿透，而且腫瘤呈膨脹浸潤性生長，會對周圍組織產生壓力，這樣可使腫瘤細胞更容易進入血液循環，形成轉移灶。隨著腫瘤體積的增大，新生血管形成更多，更容易復發轉移。由于CD105在惡性腫瘤中的表達可以反映出腫瘤血管生成和內皮細胞活躍情況，所以CD105的高表達可作為惡性腫瘤患者轉移和預后判斷的指標之一。有遠處轉移的肝癌患者外周血CD105陽性細胞的水平顯著高于無遠處轉移者，分期越晚，外周血CD105陽性細胞的水平越高。本研究發現腫瘤直徑＞5 cm的肝癌患者外周血CD105陽性細胞的水平高于腫瘤直徑＜5 cm的肝癌患者的CD105陽性細胞的水平。腫瘤的局部復發率隨體積的增大而增加，發生遠處轉移的機會亦越多。推測外周血CD105陽性細胞的水平升高可能與肝癌患者腫瘤復發與轉移有一定的關系，很可能對預測肝癌復發、轉移有一定價值，尚需擴大樣本量進行進一步研究。

CD105在腫瘤發生發展過程中起著重要作用，同時也與腫瘤的預后有關。CD105在HCC的診斷與治療方面起著重要作用，在靶向治療腫瘤的今天，CD105展現出了一定的臨床應用前景。

1 Li CG，Wilson PB，Bernabeu C，et al.Immunodetection and characterisation of soluble CD105 TGF-beta complexes.JimmunolMethods，1998，218:85-93.

2 Quackenbush EJ，Letarte M.Identification of several cell surface proteins of non-T non-B acute lymphoblastic leukemia by using monoclonal antibodies.J Immun，1985，134:1276.

3 Westphal JR，Willems HW，Schalkwijk CJ，et al.Characteristics and possible function of endoglin，a TGF-beta binding protein.Behring Inst Mitt，1993，92:15.

4 Li SL，Gao DL，Zhao ZH，et al.Correlation of matrix metallopro-teinase suppressor genes RECK，VEGF，and CD105 with angiogenesis and biological behavior in esophageal squamous cell carcinoma.World J Gastroenterol，2007，13:6076-6081.

5 Yu D，zhuang L，Sun X，et al.Particular distribution and expression pattern of endoglin(CDl05)in the liver of patients with hepato-cellular carcinoma.BMC Cancer，2007，7:122.

6 Miller DW，Gaulich W，Karges B，et al.Elevated expression of endoglin，a component of the TGF-beta-receptor complex，correlates with proliferation of tumor endothelial cells.Int J Cancer，1999，81:568-572.

7 Li DY，Sorensen L K，Brooke BS，et al.Defective angiogenesis in mice lacking endoglin.Science，1999，284:1534.

8 Takahashi N，Kawanishi Tabata R，Haba A，et al.Association of serum endoglin with metastasis in patients with colorectal，breast，and others olid tumors，and suppressive effect of chem.Other apyon the serum endoglin.Clin Cancer Res，2001，7:524-532.

9 Akagi K，Ikeda Y，Sumiyoshi Y，et al.Estimation of angiogenesis with anti-CD105 immunostaining in the process of colorectal cancer development.Surgery，2002，131:109-113.

10 Arrieta O，Cacho B，Morales ED，et al.The progressive elevation of alpha fetoprotein for the diagnosis of hepato cellular carcinoma in patients with liver cirrhosis.BMC Cancer，2007，8:28.

11 于興，胡章華.HCC甲胎蛋白陰性誤診84例分析.中國誤診學雜志，2003，3:1317.