磷酸化STAT3和Bcl-2在子宮內(nèi)膜異位癥的表達及相互關(guān)系

孟津 趙敏 金海紅 陳燕

子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)是一種育齡女性常見病，嚴重影響患者生活質(zhì)量。目前發(fā)病機制不明，治療后復發(fā)率高。“在位內(nèi)膜決定論”指出:子宮內(nèi)膜碎片必須經(jīng)黏附、侵襲、血管形成，方可生存、生長，并引起病變和癥狀［1］。這一過程的完成是以不同在位內(nèi)膜的不同生物學特性、甚至基因差異為基礎(chǔ)。信號傳導和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)廣泛參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移、血管發(fā)生、凋亡抵抗和免疫逃避等，可能在EMs的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。磷酸化STAT3(P-STAT3)是STAT3的活化形式。B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)是STAT3重要的靶基因，也是重要的抗凋亡基因之一，與EMs的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。本實驗采用免疫組化SP法研究P-STAT3和Bcl-2在EMs的在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜中的表達，分析它們在不同內(nèi)膜組織中表達的相關(guān)性，探討兩者在EMs發(fā)病中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究組:選取秦皇島市第一醫(yī)院婦科2008年1月至2011年1月手術(shù)及病理證實的EMs患者40例，包括增殖期23例，分泌期17例。患者年齡23～46歲，平均年齡(38±5)歲，平均體重指數(shù)(23.2 ±2.4)kg/cm2。采用 1985 美國生育協(xié)會的EMs分期標準(r-AFS):Ⅰ期3例，Ⅱ期8例，Ⅲ期12例，Ⅳ期17例。術(shù)中取得在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜標本各40例。對照組:正常子宮內(nèi)膜標本40例，包括增殖期25例，分泌期15例，年齡27～49歲，平均年齡(38±5)歲，平均體重指數(shù)(22.9±2.5)kg/cm2。2組間年齡和體重指數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。全部患者月經(jīng)規(guī)律，除外妊娠、哺乳期女性，無惡性腫瘤及其他內(nèi)科外科、婦科合并癥，術(shù)前6個月內(nèi)未接受激素治療。

1.2 主要試劑 兔抗人P-STAT3多克隆抗體購自美國CST公司。鼠抗人Bcl-2單克隆抗體、即用型快速免疫組化MaxVisionTM檢測試劑盒及DAB顯色劑購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法 標本經(jīng)10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，制成4μm厚連續(xù)切片。經(jīng)常規(guī)脫蠟、脫苯、封閉內(nèi)源性過氧化物酶及抗原修復等步驟，按照試劑盒說明書行免疫組化SP染色，中性樹膠封片后置于顯微鏡下觀察。PBS液代替一抗作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判斷 P-STAT3結(jié)果判定以子宮內(nèi)膜腺上皮細胞的細胞核著色為陽性細胞，Bcl-2結(jié)果判定以子宮內(nèi)膜腺上皮細胞的細胞漿著色為陽性。參照Fromowitz等［2］的半定量積分法，以染色強度和染色范圍進行結(jié)果判定。染色強度分為:不染色0分;淡黃色1分;黃色2分，棕黃色3分。染色范圍:隨機選取10個具有代表性的高倍鏡視野(×400)，每視野計數(shù)100個腺上皮細胞，按照陽性細胞百分率分為:0～5%計0分，6%～25%計1分，26% ～50%計2分，51% ～75%計3分，＞75%計3分。每張切片的兩分數(shù)相加計算總分:0～2分為陰性(－)，3分為弱陽性(+)，4分為陽性(++)，5～7分為強陽性(+++)。

1.5 統(tǒng)計學分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，采用t檢驗、檢驗χ2非參數(shù)Wilcoxon W檢驗、McNemar檢驗、Spearman等級相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 P-STAT3的表達 P-STAT3蛋白在對照組和研究組在位及異位內(nèi)膜中均主要表達在腺上皮細胞的細胞核，間質(zhì)也有少量表達。組間比較:P-STAT3蛋白的表達強度在研究組在位內(nèi)膜高于對照組，且增殖期和分泌期的表達強度均高于同期對照組;在研究組異位內(nèi)膜高于在位內(nèi)膜和對照組，且增殖期和分泌期的表達強度均高于同期的在位內(nèi)膜和對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。同組增殖期與分泌期比較:P-STAT3蛋白的表達強度在對照組分泌期高于增殖期，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。在研究組在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜的表達強度，增殖期與分泌期比較均差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表1、圖1～3。

表1 P-STAT3在不同子宮內(nèi)膜中的表達 例

圖1 P-STAT3在對照組子宮內(nèi)膜的陽性表達(SP×400)

圖2 P-STAT3在研究組在位內(nèi)膜的陽性表達(SP×400)

圖3 P-STAT3在研究組異位內(nèi)膜的陽性表達(SP×400)

2.2 BCL-2的表達 Bcl-2蛋白在對照組子宮內(nèi)膜和研究組在位及異位內(nèi)膜中均主要表達在腺上皮細胞的細胞漿中，基質(zhì)中也有表達。組間比較:Bcl-2蛋白的表達強度在研究組在位內(nèi)膜高于對照組，且增殖期和分泌期的表達強度均高于同期對照組;Bcl-2蛋白的表達強度在研究組異位內(nèi)膜高于在位內(nèi)膜和對照組，且增殖期和分泌期的表達強度均高于同期的在位內(nèi)膜和對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。同組增殖期與分泌期比較:Bcl-2蛋白的表達強度在對照組和研究組在位內(nèi)膜中增殖期高于分泌期，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。在研究組異位內(nèi)膜中的表達強度，增殖期與分泌期比較均差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表2、圖4。

表2 Bcl-2在不同子宮內(nèi)膜中的表達 例

圖4 Bcl-2在研究組在位內(nèi)膜中的陽性表達(SP法×100)

2.3 STAT3與Bcl-2表達的相關(guān)性分析 研究組在位內(nèi)膜的增殖期中P-STAT3和Bcl-2的表達強度呈正相關(guān)(r=0.89，P=0.00)，分泌期中P-STAT3和Bcl-2的表達強度呈正相關(guān)(r=0.87，P=0.00);研究組異位內(nèi)膜的增殖期中 P-STAT3和Bcl-2的表達強度呈正相關(guān)(r=0.94，P=0.00)，分泌期中 PSTAT3和 Bcl-2的表達強度呈正相關(guān)(r=0.98，P=0.00)。對照組的增殖期中P-STAT3和Bcl-2無相關(guān)性(P=0.06);分泌期中P-STAT3和Bcl-2的表達強度無相關(guān)性(P=0.17)。

3 討論

3.1 STAT3與EMs的關(guān)系 STAT3是重要的癌基因，其過度激活與腫瘤的異常增生、侵襲轉(zhuǎn)移、凋亡抵抗、血管發(fā)生和免疫抑制等密切相關(guān)。而異位內(nèi)膜類似腫瘤的生物學行為是EMs發(fā)病的關(guān)鍵［3］。STAT3可能通過參與凋亡抵抗、血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移和免疫逃避等途徑參與EMs發(fā)病。

3.1.1 P-STAT3在正常子宮內(nèi)膜的表達和意義:Dimitriadis等［4］認為，P-STAT3免疫反應(yīng)性在月經(jīng)周期的分泌期最大化，在分泌中期子宮內(nèi)膜容受囊胚植入時達峰值。本研究表明，PSTAT3在分泌期的表達高于增殖期，支持STAT3參與子宮內(nèi)膜蛻膜化的觀點。

3.1.2 P-STAT3在 EMs的表達和意義:本研究發(fā)現(xiàn)，P-STAT3在在位及異位內(nèi)膜中均主要表達在腺上皮細胞的細胞核，與正常子宮內(nèi)膜中的表達一致［4］。P-STAT3在在位和異位內(nèi)膜中高表達，且與月經(jīng)周期不同時相無關(guān)，表明P-STAT3的異常可能是EMs的發(fā)病原因。P-STAT3在在位內(nèi)膜中高表達，且在在位和異位內(nèi)膜中都失去周期性變化，提示在位內(nèi)膜參與EMs發(fā)病，并可能是其中關(guān)鍵，這符合“在位內(nèi)膜決定論”的觀點。研究同時發(fā)現(xiàn)，P-STAT3在異位內(nèi)膜中高表達，與月經(jīng)周期不同時相無關(guān)。提示在位內(nèi)膜的變化可能不是引發(fā)EMs的唯一原因，腹腔內(nèi)環(huán)境的改變很可能也參與其中，這與Ryan等［5］的觀點相符。

3.2 Bcl-2與EMs的關(guān)系 凋亡在EMs發(fā)生發(fā)展中的作用日益受到重視。Bcl-2是重要的抗凋亡基因，其異常表達可能通過改變子宮內(nèi)膜的正常凋亡促成EMs發(fā)病。

3.2.1 Bcl-2在正常子宮內(nèi)膜的表達和意義:本研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2在正常子宮內(nèi)膜中主要表達在腺上皮細胞的細胞漿，增殖期的表達高于分泌期。這與Gompel等［6］的研究結(jié)果一致，提示其參與調(diào)控子宮內(nèi)膜的周期性改變。

3.2.2 Bcl-2在EMs的表達和意義:本研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2在在位和異位內(nèi)膜中均主要表達在腺上皮細胞的細胞漿，與在正常子宮內(nèi)膜的表達一致。Bcl-2在在位和異位內(nèi)膜中高表達，且與月經(jīng)周期不同時相無關(guān)。Bcl-2在在位內(nèi)膜中的表達增殖期高于分泌期，在異位內(nèi)膜中失去周期性變化。這與Watanabe等［7］的研究結(jié)果一致，提示Bcl-2的異常可能參與EMs發(fā)病。本研究表明，Bcl-2在異位內(nèi)膜中的表達高于在位內(nèi)膜，并失去周期性變化，提示在位內(nèi)膜中Bcl-2的變化可能參與子宮內(nèi)膜的發(fā)病，但腹腔內(nèi)環(huán)境的改變進一步影響B(tài)cl-2的表達，并可能最終促成EMs的發(fā)生。

3.3 EMs的在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜中STAT3與 Bcl-2表達的關(guān)系 本研究表明，P-STAT3和Bcl-2在不同月經(jīng)周期的正常子宮內(nèi)膜中的表達強度不相關(guān)，而在不同月經(jīng)周期的在位和異位內(nèi)膜中分別呈正相關(guān)。提示上調(diào)Bcl-2的表達是STAT3促進EMs發(fā)病的可能途徑。

綜上所述，P-STAT3和Bcl-2在EMs的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。STAT3通路通過對Bcl-2的調(diào)控改變子宮內(nèi)膜的正常凋亡是其參與EMs發(fā)病的可能方式之一，與腹腔內(nèi)環(huán)境中基因的變化共同促成EMs的發(fā)生。

1 郎景和.子宮內(nèi)膜異位癥研究的新里程.中華婦產(chǎn)科雜志，2005，40:3-4.

2 Fromowitz FB，Viola MV，Chao S，et al.Ras p21 expression in the progression of breast cancer.Hum Pathol，1987，18:1268-1275.

3 Harada T，Taniguchi F，Izawa M，et al.Apoptosis and endometriosis.Front Biosci，2007，12:3140-3151.

4 Dimitriadis E，Stoikos C，Tan YL，et al.Interleukin 11 signaling components signal transducer and activator of transcription 3(STAT3)and suppressor of cytokine signaling 3(SOCS3)regulate human endometrial stromal cell differentiation.Endocrinology，2006，147:3809-3817.

5 Ryan IP，Taylor RN.Endometriosis and infertility:new concepts.Obstet Gynecol Surv，1997，52:365-371.

6 Gompel A，Sabourin JC，Martin A，et al.Bcl-2 expression in normal endometrium during the menstrual cycle.Am J Pathol，1994，144:1195-1202.

7 Watanabe H，Kanzaki H，Narukawa S，et al.Bcl-2 and Fas expression in eutopic andectopic human endometrium during the menstrual cycle in relation to endometrial cell apoptosis.Am J Obstet Gynecol，1997，176:360-368.