P-選擇素、CD44V6的表達與乳腺癌轉移的關系研究

黃秀英 唐福興 李鳳玲 齊磊巖 張穎 張素華

乳腺癌是危害女性健康最常見的惡性腫瘤之一，遠處轉移是危及患者生命的主要原因。P-選擇素是細胞黏附分子選擇素家族中的重要成員，P-選擇素在腫瘤的轉移過程中發(fā)揮了極為重要的作用。CD44是近年來研究較多的細胞表面黏附分子，是細胞與細胞、細胞與ECM相互識別和作用的分子基礎［1］。雖然 P-選擇素基因的高表達、CD44基因的變異型CD44V6的出現(xiàn)提示了惡性腫瘤轉移的傾向。但兩項指標在乳腺癌中的表達及其相互作用關系的研究筆者還鮮見報道。

1 材料與方法

1.1 材料 收集保定市第四醫(yī)院病理科2000年1月至2010年5月手術切除的蠟塊存檔標本93例，患者全部為女性，術前未接受任何輔助治療，所有病例的臨床及病理資料完整。切除標本由2名病理醫(yī)師做出詳細的病理診斷，包括病灶的大小、病理組織學類型、組織學分級、淋巴結轉移等情況。其中乳腺導管內癌(DCIS)25例，乳腺浸潤性導管癌(IDC)68例，其中48例伴有淋巴結轉移;癌旁正常乳腺組織17例(取自距離乳腺癌組織邊緣5 cm以上)作為對照組。

1.2 病理檢查 所有病理標本均經4%的甲醛液固定，石蠟包埋，常規(guī)制片，HE染色。采用S-P法進行P-選擇素、CD44V6二種抗體免疫組織化學染色，濃縮型兔抗人P-選擇素多克隆抗體，工作液濃度為1∶50，購自武漢博士德公司，即用型鼠抗人CD44V6單克隆抗體，為福州邁新生物技術開發(fā)有限公司產品。用已知陽性切片做陽性對照，用已知陽性的乳腺癌切片，以PBS代替一抗，作為陰性對照。胞質(P-選擇素)及細胞膜(CD44V6)出現(xiàn)黃色至棕黃色顆粒為陽性，相應部位未出現(xiàn)黃色至棕黃色顆粒為陰性。

1.3 判斷標準［2，3］每張切片選取5個高倍鏡視野，每個高倍視野下隨機計數(shù)100個細胞，陽性表達者呈黃色至棕黃色顆粒，計算出陽性表達的細胞所占的百分比。結果判斷標準:著色細胞＜10%為陰性，≥10%為陽性。著色細胞為10% ～25%為(+);25% ～50%為(++);＞50%者為強陽性(+++)。

1.4 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 P-選擇素、CD44V6蛋白表達 P-選擇素、CD44V6蛋白陽性標記呈黃色或棕黃色顆粒，P-選擇素陽性標記位于細胞漿(圖1、2)，CD44V6 蛋白陽性標記位于細胞膜(圖3、4)。P-選擇素、CD44V6蛋白在DCIS組和IDC組的陽性率和強陽性率均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。CD44V6在DCIS組的強陽性表達率明顯低于IDC組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表1。

圖1 P-選擇素(+++)定位于細胞質(SP×100)

圖2 P-選擇素(+++)在導管原位癌中的表達(SP×100)

圖3 CD44V6(+++)定位于細胞膜(SP×400)

圖4 CD44V6(+++)在浸潤性導管癌中的表達(SP×40)

表1 P-選擇素、CD44V6蛋白表達情況 例(%)

2.2 乳腺IDC中P-選擇素、CD44V6蛋白表達與臨床病理特征的關系 P-選擇素、CD44V6蛋白與淋巴結轉移組與無淋巴結轉移組及不同分化程度間的差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 乳腺IDC中P-選擇素、CD44V6蛋白表達與臨床病理特征的關系例(%)

2.3 P-選擇素與CD44V6蛋白表達的相關性 P-選擇素呈陽性表達的83例乳腺癌中有74例CD44V6呈陽性表達;P-選擇素呈陰性表達的10例中有6例CD44V6也呈陰性表達。兩者存在明顯的正相關(χ2=15.942，r=0.414，P＜0.01)。

3 討論

P-選擇素屬選擇素家族的重要成員，亦稱 P-選擇蛋白、CD62P、顆粒膜蛋白140(granule membrane protein，GMP-140)或血小板活化依賴性顆粒表面膜蛋白(platelet activation dependent granule external membrane protein，PADGEM)。P-選擇素是一種由789個氨基酸殘基構成的相對分子質量為140KD的跨膜糖蛋白。其染色體定位于1q21-24［4］，其結構可以分為5個區(qū)域:(1)3個區(qū)域共同構成了N末端的胞外區(qū)，即1個凝集素樣區(qū)、一個表皮生長因子樣區(qū)和9個補體調節(jié)蛋白重復單位。(2)C末端的24個氨基酸組成跨膜區(qū)。(3)35個氨基酸組成胞漿短尾區(qū)，P-選擇素的胞外凝集素樣區(qū)域是識別并結合其相應的配體的功能部位［5］。

P-選擇素在靜息狀態(tài)下存在于血小板的α顆粒及內皮細胞的W-P小體中，其表面無P-選擇素表達或呈持續(xù)低表達狀態(tài)。在病理情況下，血小板及內皮細胞被某些成分(如LPS、組胺、血栓素、過氧化物、蛋白激酶 C、補體系統(tǒng)、ADP、TNF-α、ILlβ、LPS、TNF-α等)刺激而激活，P-選擇素可出現(xiàn)異常表達。選擇素有很多種配體，P-選擇素能與其配體PSGL-1呈高親和力結合，有報道不同階段的黑色素瘤患者血漿中P-選擇素均高于正常人，且與病情發(fā)展呈正相關［6］。Nair等［7］在食道癌患者的血漿中也檢測出P-選擇素的含量是升高的。Iwamura等［8］首先發(fā)現(xiàn)胰腺癌細胞(SUIT-2)中有P-選擇素的表達，P-選擇素的高表達還出現(xiàn)在胃癌、腎癌、肺癌、膠質瘤及卵巢惡性腫瘤中。Renkonen等［9］發(fā)現(xiàn)乳腺癌原發(fā)灶的癌細胞P-選擇素的表達明顯高于正常乳腺上皮細胞的表達。Fox等［10］也發(fā)現(xiàn)P-選擇素在浸潤性乳腺癌組織中的表達是增強的。Peeters等［11］注意到P-選擇素的高表達也與結腸直腸癌的惡性程度有關。周同等［12］在60例胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)P-選擇素的過度表達與其分化程度無關系;與腎癌、卵巢惡性腫瘤的組織學類型無關;與胃癌、腎癌、肺癌、膠質瘤及卵巢惡性腫瘤患者的性別及發(fā)病年齡也無關;Caine等［13］發(fā)現(xiàn)乳腺癌特別是伴有轉移的乳腺癌患者的血小板黏附性增高，此改變與P-選擇素有關。且P-選擇素單抗對腫瘤轉移有抑制作用。結合我們的實驗與上述報道發(fā)現(xiàn)，P-選擇素基因過度表達的現(xiàn)象出現(xiàn)于多種組織和類型的惡性腫瘤中，P-選擇素的過表達可能與乳腺癌的演進有關。乳腺癌P-選擇素基因呈現(xiàn)異常表達的亞克隆細胞群，通過其自身表達P-選擇素而上調血管內皮細胞和血小板P-選擇素的異常高表達，從而在癌細胞與脈管間出現(xiàn)雙重介導作用。最終導致乳腺癌發(fā)生淋巴結轉移，也使臨床TNM分期增高。提示P-選擇素有可能成為較好的具有高轉移傾向的乳腺癌預測指標和術后復發(fā)的監(jiān)測指標。

人類CD44基因是由Dalchau等［14］于1980年用單克隆抗體技術檢測并最先發(fā)現(xiàn)，該基因定位于11號染色體短臂上(11P13)，CD44分子分2類:(1)標準型CD44(CD44S)，僅由組成型外顯子編碼而成，其分子量為80～90 kDa。(2)變異型CD44(CD44V)，目前已發(fā)現(xiàn)有十幾種CD44V。這種不同的拼接方式使得其分子量范圍較大80～230 kDa。CD44基因是黏附分子家族成員之一，其編碼的產物是由胞外、跨膜及胞質3個部分構成的跨膜糖蛋白，胞膜外區(qū)是CD44分子發(fā)揮生物學功能的重要結構。其主要功能:(1)參與淋巴細胞的激活，調節(jié)免疫功能。參與細胞間、細胞與ECM的黏附;(2)介導淋巴細胞在血液和淋巴液間運行、并將淋巴細胞歸還到淋巴組織(淋巴細胞歸巢)，故CD44又稱歸巢受體;(3)參與免疫調節(jié)，以及淋巴細胞的激活過程;(4)能夠與細胞骨架蛋白結合，參與細胞的偽足形成及遷移運動;(5)CD44可在不同水平被調節(jié)，參與腫瘤的侵襲和轉移。

Hofmann等［15］用Notherm印跡法研究了多個體外培養(yǎng)的人癌細胞系，在肺癌、膀胱癌、食道癌、乳腺癌、腎癌、肝癌、宮頸癌和非何杰金淋巴瘤、結腸癌等中發(fā)現(xiàn)有CD44V表達。Sinn等［16］研究表明，CD44V6表達與大鼠乳腺癌組織學分級有關。Liu等［17］應用免疫組化檢查了胃腺癌和結腸直腸腺癌各62例，發(fā)現(xiàn)CD44V6與對照組相比只在癌組織中表達，CD44V6的高表達與病理分級、浸潤程度有關。Yamamichi等［18］進一步對CD44在多種臟器惡性腫瘤的研究認為CD44V5、CD44V6的表達與腫瘤進展程度關系密切。Matsumura等［19］在1992年首次應用雜交法證實乳腺癌組織中CD44過表達，認為CD44表達與乳腺癌預后有關。結果顯示，CD44V6在乳腺導管內癌與導管浸潤癌的蛋白表達均明顯增強，隨著CD44V6的蛋白表達增強，導管內癌的侵襲能力增加而演變成導管浸潤癌。我們的結果支持了CD44V6與惡性腫瘤的轉移及臨床分期相關的結論。CD44V6的表達與乳腺癌原發(fā)灶的大小和患病年齡無關。認為腫瘤轉移可能與CD44S和CD44V的表達失衡有關。CD44S丟失提示細胞間黏附能力減弱，惡性瘤細胞易于浸潤。也有提出腫瘤細胞表達的過量CD44與間質的透明質酸相互作用促使其擴散而侵入血管或淋巴管，CD44V6高表達的癌細胞可能獲得淋巴細胞樣的“偽裝”，逃避人體免疫系統(tǒng)的識別和殺傷，更容易進入淋巴結，繼而導致轉移。

關于P-選擇素與CD44兩者相互作用的機制，本結果顯示，P-選擇素呈陽性表達的83例乳腺癌中有74例CD44V6呈陽性表達，兩者呈明顯的正相關關系(r=0.414，P＜0.05)。研究發(fā)現(xiàn)，在結腸癌細胞系LS174T細胞表面的CD44V是一個類似P-選擇素配體PSGL-1的功能性配體，其結合的位點也類似于PSGL-1［6］。結合上述報道推測:(1)過度表達CD44V6的乳腺癌細胞，容易與ECM黏附并通過改變細胞骨架蛋白的構型，參與細胞偽足的形成，促進細胞侵入脈管壁;(2)P-選擇素的高表達，使侵入脈管的癌細胞很快與血小板結合形成瘤細胞栓子;(3)而P-選擇素與CD44V6兩者協(xié)同作用，使癌細胞獲得淋巴細胞樣的偽裝，瘤細胞栓子的形成與淋巴細胞樣偽裝的獲得，似一封閉的載體協(xié)助癌細胞逃避了機體的免疫殺傷作用，完成血液與淋巴液之間的循環(huán)，并歸巢于淋巴結，最終使得淋巴結轉移成為可能。

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