小檗堿對人肝癌細胞系SMMC-7721細胞增殖和凋亡的影響

黃勤杰 施超 朱健

小檗堿是從我國傳統中藥黃連、黃柏中提取的一種生物堿，研究表明小檗堿有抑制多種惡性腫瘤細胞系增殖和遷移的作用［1－3］。本研究通過小檗堿作用于人肝癌細胞系 SMMC-7721細胞株，探討其對SMMC-7721細胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物 鹽酸小檗堿購于中國藥品生物制品檢定所。溶于120 mmol/L的 HEPES調節液(pH值7.4)中，配制成100 μg/ml的儲備液，超濾除菌，－20℃保存。

1.2 細胞培養及分組 人肝癌細胞系SMMC-7721細胞株由南京醫科大學第二附屬醫院腫瘤科陸彬彬饋贈，在含有10%小牛血清的RPMI-1640培養液中，于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下常規培養，傳代保存。對照組為加入RPMI 1640培養液的SMMC-7721 細胞，實驗組為分別加入 10、20、40、60 μg/ml的小檗堿的SMMC-7721細胞。

1.3 MTT法 取對數生長期各組細胞接種于96孔板，每孔1 ×103個細胞，取 6 個復孔，實驗組分為 10、20、40、60 μg/ml 4個濃度，分別培養 0、24、48、72 h 后加 MTT(5 mg/ml)20 μl/孔，37℃，5%CO2。孵箱中繼續孵育 4 h，棄上清，加 DMSO 150 μl/孔，振蕩20 min，使結晶充分溶解，在490 nm波長的酶聯儀上檢測各組的A值，繪制細胞生長曲線。

1.4 流式細胞分析 2組的MMC-7721細胞各培養48 h，經胰酶消化，制成單細胞懸液，PBS洗1次，70%冷乙醇固定，DAPI染色，上樣于流式細胞儀進行細胞周期分析。

1.5 軟瓊脂克隆形成試驗 2組的MMC-7721細胞各培養24 h，將1.2%的低熔點瓊脂糖與2×1640等體積混合，取1 ml鋪于24孔板，室溫下使其凝固待用。將0.7的低熔點瓊脂糖與含5組SMMC-7721細胞的2×1640等體積混合，取1 ml鋪于頂層，每組做6個復孔，每孔含500個細胞。待頂層瓊脂凝固后，置37℃、5%CO2孵箱中培養2周，觀察5組細胞克隆形成情況。

1.6 統計學分析應用SPSS 11.5統計軟件，計量資料以表示，采用方差分析對各組細胞周期和軟瓊脂克隆形成率進行分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTT法 4組細胞的生長曲線，可見小檗堿對人肝癌細胞株SMMC-7721細胞增殖的抑制作用隨時間延長和劑量增加而增加。見圖1。

圖1 4組細胞的生長曲線

2.2 流式細胞分析檢測細胞凋亡 在對照組和小檗堿:0 μg/ml組中未檢測到明顯亞二倍體峰，小檗堿10～60 μg/ml組均檢測到典型的亞二倍體峰，隨小檗堿劑量增加，亞二倍體峰面積明顯增加，細胞凋亡率增加。見表1、圖2。

表1 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率%，±s

表1 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率%，±s

注:與小檗堿 0 μg/ml比較，*P ＜0.01

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圖2 流式細胞儀檢測5組細胞凋亡率

2.3 軟瓊脂克隆形成試驗 低倍鏡下計數30個細胞以上的克隆:鹽酸小檗堿各濃度組與實驗對照組比較，差異有統計學意義(P＜0.01)。說明小檗堿對SMMC-7721細胞的克隆形成能力隨藥物濃度增加而增加。見表2。

表2 5組細胞軟瓊脂克隆形成試驗n=6，%，±s

表2 5組細胞軟瓊脂克隆形成試驗n=6，%，±s

注:與對照組比較，*P ＜0.01

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3 討論

肝癌是目前我國發病率和病死率均居前列的惡性腫瘤，雖然目前手術及介入已經提高了肝癌的生存時間，但晚期肝癌目前治療效果比較差，需要我們尋找新的治療方法。

中藥是我國的傳統瑰寶，在其中有許多對惡性腫瘤有效的藥物，而且目前研究天然植物抗腫瘤藥物成為當今國際醫藥界的重點方向［4，5］。

小檗堿是從我國傳統中藥黃連、黃柏中提取的一種生物堿，研究表明小檗堿可以誘導胃癌細胞的凋亡［6］，同時小檗堿也可以抑制乳腺癌細胞系 MCF-7和MDA-MB-231的生長［7］。有研究顯示小檗堿抑制惡性腫瘤的增殖與Wnt/β-catenin信號通路相關［8］。

本研究結果表明小檗堿對人肝癌細胞株SMMC-7721細胞增殖有抑制作用，該作用隨小檗堿的濃度和作用時間的增加而增加，同時小檗堿也有促人肝癌細胞株SMMC-7721細胞凋亡的作用，并隨小檗堿的濃度增加而增加。同時隨著小檗堿的濃度的增加，人肝癌細胞株SMMC-7721細胞克隆形成能力也出現下降。

綜上所述，鹽酸小檗堿可以抑制人肝癌細胞株SMMC-7721細胞的增殖并誘導其細胞凋亡，這提示小檗堿可能成為一種新的抗肝癌藥物。

1 Colombo ML，Bugatti C，Mossa A，et al.Cytotoxicity evaluation of natureal cop tisine and synthesis of cop tisine from Berberine.Farmaco，2001，56:403-409.

2 Orfila L，Rodriguez M，Colman T，et al.Structuralmodification of berberine alkaloids in relation to cytotoxic activity in vitro.J Ethnopharmacol，2000，71:449-456.

3 Iizuka N，Miyamoto K，Okita K，et al.Inhibitory effect of cop tidis rhizoma and berberine on the proliferation of human esophageal cancer cell lines.CancerLett，2000，148:19-25.

4 Kizaki H，Onishi Y.TopoisomeraseⅡ Inhibitor Induced apoptosis in thymocytes and lymphoma cells.Adv Enzyme Regul，1997，37:403-423.

5 Lee KH.Anticancer drug design based on plant derived natural products.J Biomed Sci，1999，6:236-250.

6 李國英，楊林西，王玉平，等.小檗堿對人胃癌細胞株BGC2823誘導凋亡的研究.中藥藥理與臨床，2005，21:16-18.

7 Kim JB，Lee KM，Ko EY，et al.Berberine inhibits growth of the breast cancer cell lines MCF-7 and MDA-MB-231.Planta Med，2008，74:39-42.

8 何百成，康全，楊俊卿，等.小檗堿抗腫瘤作用與Wnt/β2catenin信號轉導關系.中國藥理學通報，2005，21:1108-1111.