氟比洛芬酯預(yù)先給藥對(duì)大鼠肝臟缺血再灌注損傷的影響

李永剛 米樂(lè) 王民 張英

缺血再灌注損傷是一系列因素綜合作用所引起的病理和生理反應(yīng)。缺血可嚴(yán)重?fù)p傷組織細(xì)胞，組織再灌注會(huì)產(chǎn)生大量的氧自由基，這些氧自由基可進(jìn)一步加重細(xì)胞的損傷。氟比洛芬酯是一種非選擇性的環(huán)氧合酶抑制劑，通過(guò)抑制前列腺素的合成起到抗炎、鎮(zhèn)痛作用。有研究報(bào)道，氟比洛芬酯靜脈預(yù)先給藥可以減輕大鼠的腦缺血再灌注損傷［1－3］，本研究在此基礎(chǔ)上探討氟比洛芬酯預(yù)先給藥對(duì)大鼠肝臟缺血再灌注損傷的影響，并探討其對(duì)肝臟的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物選擇、分組與給藥方法 雄性健康SD大鼠48只，體重250～300 g，鼠齡6～8周。由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為假手術(shù)組(S組)、缺血再灌注組(I/R組)和氟比洛芬酯預(yù)先給藥組(FB組)，每組16只。大鼠肝臟缺血再灌注模型的制備參照Nauta法建立大鼠肝臟部分缺血再灌注損傷模型，術(shù)前實(shí)驗(yàn)動(dòng)物禁食12 h，自由進(jìn)水，乙醚吸入麻醉，上腹部正中切口，切開(kāi)腹壁各層，顯露第一肝門(mén)部，暴露肝臟左、中葉之肝蒂，離斷肝至橫膈及腹壁的韌帶，用無(wú)損傷血管夾將供應(yīng)肝左葉、中葉血的門(mén)靜脈和肝動(dòng)脈分枝阻斷60 min，使約70%的肝臟缺血，以防止發(fā)生嚴(yán)重腸系膜靜脈瘀血，然后取下血管夾恢復(fù)肝臟血供6 h。S組只行開(kāi)腹及暴露左、中肝葉肝蒂，不阻斷肝葉供血;I/R組參照Nauta法建立肝臟部分再灌注損傷模型，缺血前15 min自尾靜脈注射等容量的0.9%氯化鈉溶液，左、中肝葉缺血60 min，再灌注6 h;B組缺血前15 min自尾靜脈注射氟比洛芬酯10 mg/kg，左、中肝葉缺血60 min，再灌注6 h;于再灌注6 h時(shí)切取肝臟組織。(1)從大鼠的腹主動(dòng)脈采集血液2 ml，提取血液標(biāo)本，提取后的血清放在冰箱－80℃保存，待測(cè)。(2)處理肝組織:切取約為1 mm3的肝臟組織，馬上放入2.5%戊二醛中固定，固定的肝組織用于電鏡觀查;用4%的多聚甲醛固定適量的肝組織，固定后通過(guò)脫水、透明和浸蠟等過(guò)程做成石蠟包塊，待測(cè);一部分肝組織標(biāo)本按重量加入0.9%氯化鈉溶液做成10%的肝組織勻漿，用以檢測(cè)丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的含量。

1.2 主要藥物、試劑與儀器 氟比洛芬酯(50 mg/5 ml，北京泰德制藥有限公司);SOD試劑盒(A-001，建成生物工程公司，南京);MDA試劑盒(A-003，建成生物工程公司，南京);TNF-α試劑盒(博士德生物工程研究所，武漢);NF-κB免疫組化試劑盒(Santa Cruz公司，美國(guó));Selectra-E自動(dòng)生化分析儀(姍頓公司，英國(guó));Citadel-2002脫水器(Vita，荷蘭);Histocentrez包埋儀(Vita，荷蘭);AS425切片機(jī)(姍頓公司，英國(guó));YT8B烤片機(jī)(孝亞光電子技術(shù)公司，湖北);YNY781B微波儀(臨安電子器材研究所，浙江);BHS顯微鏡(姍頓公司，英國(guó));眼科無(wú)損傷鑷，眼科持針器，血管鉗，眼科無(wú)損傷動(dòng)脈夾等均購(gòu)自天津醫(yī)療器械廠。血清的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)含量和透明質(zhì)酸(HA)含量分別采用Selectra-E自動(dòng)生化分析儀(姍頓公司，英國(guó))和放射免疫法監(jiān)測(cè)。肝組織的MDA含量和SOD活性分別由硫代巴比妥酸(TBA)和黃嘌呤氧化酶法測(cè)定。肝臟標(biāo)本的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達(dá)和核因子-κB(NF-κB)的表達(dá)分別由免疫酶聯(lián)吸附試驗(yàn)法(ELISA)和免疫組化法檢測(cè)。在電鏡下觀察由伊紅(HE)染色的肝組織的形態(tài)學(xué)改變。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，計(jì)量資料先行正態(tài)性檢驗(yàn)，再行方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組觀察指標(biāo)比較 與S組比較，I/R組肝組織的ALT、HA及 TNF-α 水平、MDA 含量、NF-κB 表達(dá)升高(P＜0.05)，SOD活性下降(P＜0.05);與 I/R組比較，F(xiàn)B組 ALT、HA及TNF-α 水平、MDA 含量、NF-κB 表達(dá)降低(P＜0.05)，SOD 活性增高(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 電鏡下情況 可見(jiàn)肝臟組織中的線粒體腫脹，并逐漸加重，數(shù)量減少(由45% ～55%縮減到5% ～12%)，嵴變短，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的擴(kuò)張逐漸嚴(yán)重，有明顯的脫顆粒現(xiàn)象。FB組損傷程度輕于I/R組。

表1 3組觀察指標(biāo)比較n=16，±s

表1 3組觀察指標(biāo)比較n=16，±s

注:與 S組比較，*P ＜0.05;與 I/R 組比較，#P ＜0.05

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3 討論

本研究參照文獻(xiàn)［3，4］，制備大鼠肝臟缺血再灌注損傷模型，結(jié)果表明，與S組相比，再灌注6 h后，I/R組肝臟AST、HA水平升高，SOD活性降低，提示模型制備成功。

氟比洛芬酯是一種非選擇性的環(huán)氧合酶抑制劑，藥理作用是通過(guò)羧基酯酶水解生成氟比洛芬。通過(guò)抑制前列腺素的合成起到抗炎，鎮(zhèn)痛作用。氟比洛芬酯減輕缺血再灌注損傷呈劑量依賴性，10 mg/kg的效果最好，注射氟比洛芬酯15 min后，抗炎鎮(zhèn)痛效應(yīng)達(dá)最高水平，故本研究中選用此劑量在缺血前15 min給藥［5］。

ALT含量和HA的含量是當(dāng)前臨床上評(píng)估肝臟功能的主要指標(biāo)，也是敏感指標(biāo)，當(dāng)肝功能受到損傷時(shí)這兩個(gè)指標(biāo)會(huì)明顯升高。再灌注的時(shí)候產(chǎn)生大量促炎因子及氧自由基，激活NF-κB，進(jìn)而進(jìn)一步誘導(dǎo)促炎因子的產(chǎn)生，如 TNF-α。TNF-α 的受體主要集中在肝臟，所以說(shuō)肝臟是TNF-α作用的最主要的靶器官。缺血再灌注可引起TNF-α的過(guò)度表達(dá)，TNF-α的過(guò)度表達(dá)將導(dǎo)致大量的肝細(xì)胞發(fā)生炎性壞死。人體最主要的氧自由基清除劑是SOD，其作用是使細(xì)胞免受氧自由基的損傷，所以SOD活力的高低可以間接反映出機(jī)體抗氧自由基損傷的能力。MDA含量的多少可以反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的程度，也可以間接的反映機(jī)體生成了多少的氧自由基，從而可以推測(cè)這些氧自由基機(jī)對(duì)機(jī)體細(xì)胞攻擊的嚴(yán)重程度。

本結(jié)果表明FB組的ALT、HA和 TNF-α水平、光鏡下組織形態(tài)學(xué)變化均優(yōu)于I/R組。本研究還發(fā)現(xiàn)肝臟組織的MDA含量升高，說(shuō)明在肝臟的缺血再灌注損害過(guò)程中發(fā)生了脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。2組比較，F(xiàn)B組SOD活性高于I/R組，MDA、NF-κB含量低于I/R組其機(jī)制可能氟比洛芬酯抗炎癥作用有關(guān)。

綜上所述，氟比洛芬酯預(yù)先給藥可以降低大鼠肝臟的缺血再灌注損傷，其機(jī)制可能與氟比洛芬酯的抗炎作用有關(guān)。

1 孫寶柱，張岫，陳琳，等.氟比洛芬酯后處理對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注時(shí)神經(jīng)元凋亡的影響.中華麻醉學(xué)雜志，2011，31:995-997.

2 吳會(huì)生，郭培培，張宗澤，等.氟比洛芬酯預(yù)先給藥對(duì)全腦缺血再灌注大鼠血腦屏障通透性的影響.中華麻醉學(xué)雜志，2010，30:1384-1387.

3 Kamada N，Calne RY.Orthotopic liver transplantation in the rat.Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage.Transplantation，1979，47:428-431.

4 Kamada N，Calne RY.A surgical experience with five hundred and thirty liver transplants in the rat.Surgery，1983，93:64-69.

5 Wang C，Liu JL，Sang HF，et al.Therapeutic time window of flurbiprofen axetil’s effect in rat model of transient focal cerebral ischemia.Chin Med J，2008，121:2572-2577.