氟比洛芬酯預先給藥對大鼠肝臟缺血再灌注損傷的影響

李永剛 米樂 王民 張英

缺血再灌注損傷是一系列因素綜合作用所引起的病理和生理反應。缺血可嚴重損傷組織細胞，組織再灌注會產生大量的氧自由基，這些氧自由基可進一步加重細胞的損傷。氟比洛芬酯是一種非選擇性的環氧合酶抑制劑，通過抑制前列腺素的合成起到抗炎、鎮痛作用。有研究報道，氟比洛芬酯靜脈預先給藥可以減輕大鼠的腦缺血再灌注損傷［1－3］，本研究在此基礎上探討氟比洛芬酯預先給藥對大鼠肝臟缺血再灌注損傷的影響，并探討其對肝臟的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物選擇、分組與給藥方法 雄性健康SD大鼠48只，體重250～300 g，鼠齡6～8周。由河北醫科大學實驗動物中心提供。隨機分為假手術組(S組)、缺血再灌注組(I/R組)和氟比洛芬酯預先給藥組(FB組)，每組16只。大鼠肝臟缺血再灌注模型的制備參照Nauta法建立大鼠肝臟部分缺血再灌注損傷模型，術前實驗動物禁食12 h，自由進水，乙醚吸入麻醉，上腹部正中切口，切開腹壁各層，顯露第一肝門部，暴露肝臟左、中葉之肝蒂，離斷肝至橫膈及腹壁的韌帶，用無損傷血管夾將供應肝左葉、中葉血的門靜脈和肝動脈分枝阻斷60 min，使約70%的肝臟缺血，以防止發生嚴重腸系膜靜脈瘀血，然后取下血管夾恢復肝臟血供6 h。S組只行開腹及暴露左、中肝葉肝蒂，不阻斷肝葉供血;I/R組參照Nauta法建立肝臟部分再灌注損傷模型，缺血前15 min自尾靜脈注射等容量的0.9%氯化鈉溶液，左、中肝葉缺血60 min，再灌注6 h;B組缺血前15 min自尾靜脈注射氟比洛芬酯10 mg/kg，左、中肝葉缺血60 min，再灌注6 h;于再灌注6 h時切取肝臟組織。(1)從大鼠的腹主動脈采集血液2 ml，提取血液標本，提取后的血清放在冰箱－80℃保存，待測。(2)處理肝組織:切取約為1 mm3的肝臟組織，馬上放入2.5%戊二醛中固定，固定的肝組織用于電鏡觀查;用4%的多聚甲醛固定適量的肝組織，固定后通過脫水、透明和浸蠟等過程做成石蠟包塊，待測;一部分肝組織標本按重量加入0.9%氯化鈉溶液做成10%的肝組織勻漿，用以檢測丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的含量。

1.2 主要藥物、試劑與儀器 氟比洛芬酯(50 mg/5 ml，北京泰德制藥有限公司);SOD試劑盒(A-001，建成生物工程公司，南京);MDA試劑盒(A-003，建成生物工程公司，南京);TNF-α試劑盒(博士德生物工程研究所，武漢);NF-κB免疫組化試劑盒(Santa Cruz公司，美國);Selectra-E自動生化分析儀(姍頓公司，英國);Citadel-2002脫水器(Vita，荷蘭);Histocentrez包埋儀(Vita，荷蘭);AS425切片機(姍頓公司，英國);YT8B烤片機(孝亞光電子技術公司，湖北);YNY781B微波儀(臨安電子器材研究所，浙江);BHS顯微鏡(姍頓公司，英國);眼科無損傷鑷，眼科持針器，血管鉗，眼科無損傷動脈夾等均購自天津醫療器械廠。血清的丙氨酸氨基轉移酶(ALT)含量和透明質酸(HA)含量分別采用Selectra-E自動生化分析儀(姍頓公司，英國)和放射免疫法監測。肝組織的MDA含量和SOD活性分別由硫代巴比妥酸(TBA)和黃嘌呤氧化酶法測定。肝臟標本的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達和核因子-κB(NF-κB)的表達分別由免疫酶聯吸附試驗法(ELISA)和免疫組化法檢測。在電鏡下觀察由伊紅(HE)染色的肝組織的形態學改變。

1.3 統計學分析應用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以表示，計量資料先行正態性檢驗，再行方差齊性檢驗，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組觀察指標比較 與S組比較，I/R組肝組織的ALT、HA及 TNF-α 水平、MDA 含量、NF-κB 表達升高(P＜0.05)，SOD活性下降(P＜0.05);與 I/R組比較，FB組 ALT、HA及TNF-α 水平、MDA 含量、NF-κB 表達降低(P＜0.05)，SOD 活性增高(P＜0.05)。見表1。

2.2 電鏡下情況 可見肝臟組織中的線粒體腫脹，并逐漸加重，數量減少(由45% ～55%縮減到5% ～12%)，嵴變短，粗面內質網的擴張逐漸嚴重，有明顯的脫顆粒現象。FB組損傷程度輕于I/R組。

表1 3組觀察指標比較n=16，±s

表1 3組觀察指標比較n=16，±s

注:與 S組比較，*P ＜0.05;與 I/R 組比較，#P ＜0.05

?

3 討論

本研究參照文獻［3，4］，制備大鼠肝臟缺血再灌注損傷模型，結果表明，與S組相比，再灌注6 h后，I/R組肝臟AST、HA水平升高，SOD活性降低，提示模型制備成功。

氟比洛芬酯是一種非選擇性的環氧合酶抑制劑，藥理作用是通過羧基酯酶水解生成氟比洛芬。通過抑制前列腺素的合成起到抗炎，鎮痛作用。氟比洛芬酯減輕缺血再灌注損傷呈劑量依賴性，10 mg/kg的效果最好，注射氟比洛芬酯15 min后，抗炎鎮痛效應達最高水平，故本研究中選用此劑量在缺血前15 min給藥［5］。

ALT含量和HA的含量是當前臨床上評估肝臟功能的主要指標，也是敏感指標，當肝功能受到損傷時這兩個指標會明顯升高。再灌注的時候產生大量促炎因子及氧自由基，激活NF-κB，進而進一步誘導促炎因子的產生，如 TNF-α。TNF-α 的受體主要集中在肝臟，所以說肝臟是TNF-α作用的最主要的靶器官。缺血再灌注可引起TNF-α的過度表達，TNF-α的過度表達將導致大量的肝細胞發生炎性壞死。人體最主要的氧自由基清除劑是SOD，其作用是使細胞免受氧自由基的損傷，所以SOD活力的高低可以間接反映出機體抗氧自由基損傷的能力。MDA含量的多少可以反映機體脂質過氧化反應的程度，也可以間接的反映機體生成了多少的氧自由基，從而可以推測這些氧自由基機對機體細胞攻擊的嚴重程度。

本結果表明FB組的ALT、HA和 TNF-α水平、光鏡下組織形態學變化均優于I/R組。本研究還發現肝臟組織的MDA含量升高，說明在肝臟的缺血再灌注損害過程中發生了脂質過氧化反應。2組比較，FB組SOD活性高于I/R組，MDA、NF-κB含量低于I/R組其機制可能氟比洛芬酯抗炎癥作用有關。

綜上所述，氟比洛芬酯預先給藥可以降低大鼠肝臟的缺血再灌注損傷，其機制可能與氟比洛芬酯的抗炎作用有關。

1 孫寶柱，張岫，陳琳，等.氟比洛芬酯后處理對大鼠局灶性腦缺血再灌注時神經元凋亡的影響.中華麻醉學雜志，2011，31:995-997.

2 吳會生，郭培培，張宗澤，等.氟比洛芬酯預先給藥對全腦缺血再灌注大鼠血腦屏障通透性的影響.中華麻醉學雜志，2010，30:1384-1387.

3 Kamada N，Calne RY.Orthotopic liver transplantation in the rat.Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage.Transplantation，1979，47:428-431.

4 Kamada N，Calne RY.A surgical experience with five hundred and thirty liver transplants in the rat.Surgery，1983，93:64-69.

5 Wang C，Liu JL，Sang HF，et al.Therapeutic time window of flurbiprofen axetil’s effect in rat model of transient focal cerebral ischemia.Chin Med J，2008，121:2572-2577.