黃芩苷干預肺腺癌細胞前后腫瘤細胞侵襲能力的變化

王英妹 鄭海峰 武鐵軍 李慶祥 張健

黃芩苷(baicalin)是從唇形科植物黃芩中提取、分離出來的黃酮類化合物，是黃芩的主要有效成分之一，具有多種藥理作用，如:抗菌、抗氧化、誘導干細胞分化等［1－3］。研究表明，黃芩苷具有抗腫瘤的作用，但對其具體的作用機制目前尚未明了［1］。肺腺癌是臨床常見的惡性腫瘤之一。隨著我國工業化進程，肺腺癌發病和病死率目前均居惡性腫瘤前列，對人民健康危害極大。手術和化學治療在肺腺癌治療中占有很重要的地位，但存在一定的局限性和不良反應。本實驗探討了baicalin對人肺腺癌細胞A549侵襲遷移的影響，并檢測了與腫瘤侵襲遷移關系密切的基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2、MMP-9、細胞間黏附分子(intercellular adhesion molecule，ICAM)-1在用藥前后表達的變化，為baicalin應用于肺腺癌的臨床治療提供一些新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株:A549肺腺癌細胞株，購自中科院上海細胞研究所。

1.1.2 藥物:Baicalin購自南京青澤醫藥公司，純度:99.1%。

1.1.3 主要試劑:Trizol試劑為美國 Invitrogen公司產品，RTPCR試劑盒購自 Promega公司;MMP-2、MMP-9、ICAM-1、GAPDH引物由上海生工生物工程公司設計合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞劃痕試驗:將肺腺癌A549細胞株傳代于玻片上，生長至100%匯合后，用無菌吸頭在玻片上劃痕。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗凈被刮下的細胞，每孔加纖連蛋白后分別加入0、0.5、1、2、4、8 mg/L baicalin，對照組加等量 0.5% 二甲基亞砜(DMSO)，孵育48 h，取出玻片，低倍視野下觀察細胞傷口愈合情況。隨機選取5個視野，計數遷移細胞的數量，以此表示細胞的遷移活性。實驗平行重復3次。計算:細胞遷移抑制率(%)=(1試驗組遷移細胞數/對照組遷移細胞數)×100%。

1.2.2 Transwell小室侵襲試驗:采用24孔板Transwell小室進行，包被有膠原基質的Millipore濾膜孔徑為8 m。分別將0、0.5、1、2、4、8 mg/L baicalin 處理的肺腺癌 A549 細胞株用0.25%胰蛋白酶消化后，以105個/孔接種于上層小室，下層小室加入10%胎牛血清(FBS)培養液，37℃孵育16 h，取出濾膜用棉拭子輕輕擦掉濾膜上層的細胞，置于中甲醇固定10 min，高倍鏡下隨機選取5個視野計數遷移至濾膜下層的細胞，實驗重復3次。抑制率(%)=(1試驗組侵襲細胞的數量/對照組侵襲細胞的數量)×100%。

1.2.3RT-PCR方法測定:MMP-2、MMP-9及 ICAM-1 mRNA 的表達2 mg/L baicalin處理肺腺癌A549細胞株48 h，收集細胞，Trizol一步法提取總RNA，按試劑盒說明進行反轉錄反應和PCR，擴增目的片段。設定PCR反應條件:95℃、5 min;然后，95℃ 30 s、58℃ 20 s、72℃ 30 s，進行 25 個循環，72℃ 延伸10 min。PCR片段經2%瓊脂糖電泳分離，凝膠成像儀掃描成像，并進行光密度分析。GAPDH基因作為內參照。各目的基因擴增片段光密度值/內參照密度值，將此比值進行比較。所用引物序列見表1。

表1 PCR所用引物序列

1.3 統計學分析應用SPSS 11.0統計軟件，計量資料以±s表示，進行ANOVA分析處理和Dunnett檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度baicalin對肺腺癌A549細胞株遷移侵襲能力的影響 細胞劃痕實驗顯示，0.5、1、2、4、8 mg/L baicalin 作用于肺腺癌A549細胞株后，對肺腺癌A549細胞株平面遷移活性均有不同程度的抑制作用，抑制率分別為(9.1±1.6)%、(19.4±3.1)%、(42.7 ± 6.4)%、(47.6 ± 6.9)%、(49.3 ± 7.7)%。Transwell小室侵襲實驗結果顯示，0.5、1、2、4、8 mg/L baicalin 作用于肺腺癌A549細胞株后16 h，細胞跨膜遷移活性的抑制率分別為(8.5 ±1.3)%、(17.4 ±2.9)%、(40.1 ±6.5)%、(45.5±6.9)%、(48.8 ±7.3)%。

2.2 Baicalin對人肺腺癌細胞株 A549 MMP-2、MMP-9及ICAM-1 mRNA表達的影響 RT-RCR結果顯示，與對照組相比，2 mg/L baicalin處理人肺腺癌細胞株A549 48 h后，MMP-2、MMP-9、ICAM-1 mRNA表達明顯降低(P＜0.01)。見表 2、圖1。

表2 Baicalin對A549細胞MMP-2、MMP-9及ICAM-1 mRNA表達的影響n=3，±s

表2 Baicalin對A549細胞MMP-2、MMP-9及ICAM-1 mRNA表達的影響n=3，±s

注:與對照組比較，*P ＜0.01

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圖1 Baicalin對A549細胞MMP-2、MMP-9及ICAM-1 mRNA表達的影響

3 討論

肺腺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發病率和病死率居各惡性腫瘤前列，同時，由于該病起病隱匿、缺乏典型癥狀，大部分病例就診時已處于中晚期，5年生存率僅約10%。目前主要治療方法是手術治療結合放射治療和化學治療等，化療在其中發揮重要作用，但化療藥物因殺瘤效果不理想且存在較大的不良反應導致臨床應用療效不佳。因此，如何尋找療效明確、不良反應小的藥物對臨床肺腺癌治療的意義重大，新型中藥開發已成為肺癌治療研究的熱點。中醫認為，肺癌發生是由于人體正氣虛弱又毒邪襲肺、或痰濕凝聚于肺，致機體陰陽失調，邪阻于肺而成積。黃芩苷為傳統中藥黃芩的主要有效成分之一，主要功效為清熱燥濕、瀉火解毒，已有報道黃芩苷能抑制人肝癌細胞的侵襲能力［4］，本實驗探討黃芩苷對肺腺癌A549細胞的侵襲遷移的影響及可能機制，為肺腺癌的綜合治療和新型中藥開發提供依據。

肺癌細胞的侵襲遷移能力的強弱是導致腫瘤惡性程度高低的基本原因，臨床絕大多數肺癌患者死于腫瘤侵襲轉移。因此本研究以細胞劃痕實驗檢測了baicalin對肺癌細胞遷移能力的影響。結果顯示，各濃度baicalin對肺腺癌細胞的遷移均有抑制作用，提示baicalin可能通過抑制細胞瘤細胞的游走而抑制肺癌進展;同時本研究以Transwell小室實驗評價了baicalin對肺癌細胞瘤細胞的侵襲和轉移能力的影響，結果同樣提示顯示baicalin可明顯抑制肺腺癌腫瘤細胞的侵襲能力，說明baicalin對肺癌細胞的侵襲遷移能力有良好的抑制作用。但本研究僅為起步階段，需要進一步進行體內實驗深入研究。

基質金屬蛋白酶(MMPs)對基底膜中細胞外基質的降解是腫瘤浸潤和轉移的重要步驟之一［5，6］。MMPs家族是一類內源性蛋白水解酶，MMP-2和MMP-9即為該家族的重要成員，這兩種酶的主要功能為降解明膠和Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型基底膜膠原，在細胞與基質間的黏附中起著重要的作用，MMP-2、MMP-9的表達與腫瘤侵襲關系密切。有研究顯示，在肺癌細胞中，MMP-2、MMP-9高表達可促進該腫瘤的浸潤、轉移［7］。本研究以baicalin作用于肺腺癌腫瘤細胞后發現處理組腫瘤細胞 MMP-2、MMP-9 mRNA水平明顯低于對照組，表明baicalin可通過下調MMP-2、MMP-9的表達起到抗肺癌的作用。細胞間黏附因子-1(ICAM-1)可促進細胞間黏附作用加強，在腫瘤免疫中起重要作用，可以促進腫瘤的侵襲進展［8］，也有研究報道ICAM-1與肺癌侵襲關系密切［9］。本研究顯示，baicalin作用于肺癌細胞后可抑制ICAM-1的表達，說明這可能也是baicalin抑制肺癌細胞侵襲的機制之一。

本研究發現baicalin對肺癌細胞的侵襲遷移能力有良好的抑制作用，值得進一步研究并進行臨床試驗。但本研究尚處于初級階段，研究還欠深入，需全面分析baicalin的抗肺癌機制，以期為肺癌綜合治療做出貢獻。

1 Zhang S，Jin Y，Zhu W，et al.Baicalin released from scutellaria baicalensis induces autotoxicity and promotes soilborn pathogens.J Chem Ecol，2010，36:329-338.

2 Li CT，Zhang WP，Fang SH，et al.Baicalin attenuates oxygen-glucose deprivation-induced injury by inhibiting oxidative stress-mediated 5-lipoxygenase activation in PC12 cells.Acta Pharmacol Sin，2010，31:137-144.

3 Liang XL，Liao ZG，Zhu JY，et al.The absorption characterization effects and mechanism of Radix Angelicae dahuricae extracts on baicalin in Radix Scutellariae using in vivo and in vitro absorption models.J Ethnopharmacol，2012，139:52-57.

4 Chiu YW，Lin TH，Huang WS，et al.Baicalein inhibits the migration and invasive properties of human hepatoma cells.Toxicol Appl Pharmacol，2011，255:316-326.

5 Baek MJ.Prognostic Role of MMPs in colorectal cancer.J Korean Soc Coloproctol，2011，27:105-106.

6 Roomi MW，Monterrey JC，Kalinovsky T，et al.Inhibition of invasion and MMPs by a nutrient mixture in human cancer cell lines:a correlation study.Exp Oncol，2010，32:243-248.

7 Gao M，Zhang JH，Zhou FX，et al.Angelica sinensis suppresses human lung adenocarcinoma A549 cell metastasis by regulating MMPs/TIMPs and TGF-β1.Oncol Rep，2012，27:585-593.

8 Wang QL，Li BH，Liu B，et al.Polymorphisms of the ICAM-1 exon 6(E469K)are associated with differentiation of colorectal cancer.J Exp Clin Cancer Res，2009，28:139.

9 Guney N，Soydinc HO，Derin D，et al.Serum levels of intercellular adhesion molecule ICAM-1 and E-selectin in advanced stage non-small cell lung cancer.Med Oncol，2008，25:194-200.