均勻設計法優化刺梨多糖的提取工藝

王 慧，黃 聰，杜 薇

(1.中國人民解放軍第四十四醫院藥劑科，貴州 貴陽 550009；2.貴陽中醫學院藥理教研室，貴州 貴陽 550002；3.貴陽中醫學院藥學系，貴州 貴陽 550002)

刺梨RosaroxburghiiTratt.f.normalisRehd.etWils為薔薇科植物，產于云貴山區及江浙丘陵地帶，尤其在貴州山區更為廣見，過去民間以果實和根入藥，用于消食健脾、收斂止瀉與解毒[1]。近代研究證明，刺梨汁富含的維生素C、維生素E及超氧化物歧化酶、刺梨多糖和多種微量元素等，具有消除自由基、降低脂質過氧化損傷、提高免疫功能等作用[2]。目前對刺梨多糖提取工藝的研究未見報道，本課題中使用均勻設計法對刺梨多糖的提取條件進行探討，確定了其最佳提取工藝，為深入進行多糖的純化、結構分析、藥理活性等研究奠定了基礎，同時為臨床的應用提供依據，現報道如下。

1 儀器與試藥

DU－70型紫外－可見分光光度計(美國貝克曼公司)。刺梨果實采自貴州貴陽、高坡、青巖、貞豐、龍里、凱里、關嶺孟關等地，經貴陽中醫學院董立莎教授鑒定為刺梨 Rosroxburghii Tratt.f.normalis Rehd.etWils的果實；濃硫酸、苯酚(重蒸)、葡萄糖等均為分析純，水為蒸餾水；苯酚試劑(取苯酚500g，加鋁片0.5g與碳酸氫鈉0.25g，蒸餾收集180℃餾分，稱取此餾分34g，加水500g置棕色瓶中，備用)。

2 方法與結果

2.1 刺梨多糖含量測定

2.1.1 溶液制備

精密稱取105℃干燥至恒重的無水葡萄糖0.2021g，置250mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得0.8084g/L葡萄糖溶液，精密吸取溶液7.00mL，用水定容至100mL，得56.59μg/mL的葡萄糖對照品溶液。精密稱取過40目篩的刺梨粗粉0.2g，各3份，置索氏提取器中，經100mL石油醚(60～90℃)回流提取至無色，藥渣揮干后，再將藥渣用100mL 85%乙醇(90℃)回流提取2 h，以除盡單糖及醇溶性雜質，藥渣揮干，置圓底燒瓶中，按均勻試驗所得最佳提取條件，即加水25mL，提取3次，每次1 h，合并3次濾液，定容至250mL容量瓶中，即為供試品溶液。

2.1.2 最大吸收波長選擇

精密量取對照品溶液，補蒸餾水至2.0mL，按正交試驗得出的最優顯色條件，在200～600 nm波長范圍內做全波長掃描，確定最大吸收波長為491 nm。

2.1.3 方法學考察

標準曲線制備：精密量取56.59μg/mL葡萄糖對照品溶液0.40，0.60，0.90，1.20，1.50，1.80，2.00mL，分別置25mL比色管中，依次加水使最終體積為2.00mL，搖勻，加5%苯酚溶液1mL，濃硫酸5mL，置40℃溫水浴中放置15min，取出放冷，測定其吸光度，以吸光度(A)為縱坐標、質量濃度(C)為橫坐標繪制工作曲線，得回歸方程 A=0.059 1C－0.028 7，r=0.999 3(n=7)。結果表明，多糖質量濃度在2.830～14.150μg/mL范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

精密度試驗：精密吸取質量濃度為56.59μg/mL的對照品溶液1.30mL 5份，按標準曲線制備項下操作，測定吸光值。結果的 RSD值為1.30%(n=5)，表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：精密吸取供試品溶液，按標準曲線制備項下操作，每隔0.5 h，測定1次吸光度，共測定5次。結果的 RSD為1.51%(n=5)，表明供試品溶液在3 h內較穩定。

重復性試驗：精密稱取同一樣品5份，每份0.2g，依法制備供試品溶液并測定。結果的 RSD為2.97%(n=5)。

加樣回收試驗：精密稱取同一樣品5份，每份約0.1g，分別精密加入一定量的葡萄糖對照品，按供試品液溶的制備方法制備溶液，依法測定含量，計算回收率。結果見表1。

表1 多糖加樣回收試驗結果(n=6)

2.1.4 換算因子確定

精密稱定刺梨多糖16.00mg，置100mL容量瓶中，以蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻作為貯備液。精密吸取貯備液0.7mL，按標準曲線制備項下方法操作，測定吸光度 A，從回歸方程中求出供試品溶液中葡萄糖的質量濃度，按下式計算換算因子，f=w/(c×d)，測得 f值為2.089 2，式中 w為多糖質量(mg)，c為多糖稀釋液中葡萄糖質量濃度(g/L)，d為多糖稀釋因素，f為換算因子。

2.1.5 樣品含量測定

精密吸取供試品溶液2.00mL，置試管中，按標準曲線制備項下方法操作，測得 A值，從回歸方程中求出供試品溶液中葡萄糖含量，按下式計算樣品中多糖含量。多糖含量(%)=(c×d×f)/ w×100%，式中，C為供試液中葡萄糖質量濃度(g/L)，d為供試液中稀釋因素，f為換算因子，w為供試品質量(mg)。結果見表2。

表2 不同產地刺梨多糖含量測定結果(n=3)

2.2 均勻試驗

2.2.1 試驗設計

根據文獻[3－4]及預試驗結果，考察的因素與水平確定為溶劑量(因素A)、提取時間(因素B)、提取次數(因素C)、提取溫度(因素D)及醇沉濃度(因素E)，見表3。采用U6(65)均勻設計，以刺梨多糖提取率作為評價指標，篩選刺梨多糖回流提取的最佳條件，均勻試驗設計見表3。隨機安排試驗，精密稱取過40目篩的刺梨粗粉10g，6份，置索氏提取器中，經100mL石油醚(60～90℃)回流提取脫脂，藥渣揮干后，再將藥渣用100 mL 85%乙醇(90℃)回流提取2 h，以除盡單糖及醇溶性雜質，藥渣揮干溶劑后，按均勻設計方案，確定加蒸餾水、提取時間、提取次數、提取溫度，合并提取液。減壓濃縮至一半，經明膠除鞣質，用氯仿和正丁醇(3∶1)多次萃取，除去蛋白質，加1%的活性炭脫色2次，抽濾，濾液加入無水乙醇使乙醇含量達到試驗設計所需的量，冰箱靜置24 h。過濾，殘渣先后用無水乙醇、丙酮、乙醚多次洗滌60℃烘干，即得較純的刺梨多糖。精密稱取刺梨多糖32.30mg，按標準曲線項下操作，測定吸光度，并計算多糖得率。結果見表3。

表3 U6(65)均勻試驗設計表

2.2.2 數據處理與結果分析

將數據用SPSS 11.0軟件進行多元回歸分析處理，得回歸方程Y=9.429－0.017A－0.283B+0.378C，其中 S=0.022 7，r=0.999 00，F=492.581，F＞Fɑ，Y的理論預測估計值為 Y= 8.476 7±0.390 8，即 Y值在(7.871 7～9.081 7)%范圍內，檢驗通過，回歸方程有意義。回歸方程及方差分析表明，影響提取效果的因素順序為C＞A＞B，即提取次數、溶劑用量、提取時間，提取溫度和醇沉濃度幾乎沒有影響，由直觀分析可知，最佳工藝為A1B1C3，即溶劑(水)用量為50倍，提取時間為1 h，提取次數為3次。從試驗的經濟條件考慮，提取溫度為80℃，醇沉濃度為80%。因此，刺梨多糖的最佳提取條件為A1B1C3D1E1。

2.2.3 驗證試驗

根據優選出的最佳提取條件提取刺梨多糖，平行試驗3份，按標準曲線制備項下操作，測定吸光度，并計算多糖得率為8.48%，RSD為1.60%。試驗驗證結果與預測結果基本接近，表明該提取條件穩定、可行。

3 討論

本試驗中采用硫酸－苯酚法測定刺梨多糖的含量，使刺梨多糖在硫酸作用下先水解成單糖，并迅速脫水，生成糖醛化合物，然后與苯酚合成有色化合物，在491 nm波長處測定吸光度，計算含量。

按均勻設計安排試驗條件，明顯減少了多因素試驗的試驗次數。對于刺梨多糖的提取，影響因素最大的是提取次數，其次是溶劑用量、提取時間，提取溫度和醇沉濃度幾乎沒有影響。均勻設計試驗驗證結果與預測結果基本接近，表明該提取條件穩定、可行。

從含量測定結果可看出，不同產地樣品中刺梨多糖的含量不同，其中關嶺刺梨多糖含量最高，即24.96%。

[1]趙學敏[清].本草綱目拾遺[M].北京：人民衛生出版社，1983：295.

[2]陳執中，陳務本.民間藥刺梨及其制劑的藥效研究和臨床應用[J].中國民族民間醫藥雜志，1994(8)：20.

[3]董鈺明，唐興文，張樹江，等.紅毛五加多糖的含量測定條件和提取工藝優選[J].中南藥學，2006，4(2)：86－88.

[4]杜清等.明黨參多糖提取工藝研究[J].現代中藥研究與實踐，2005，19(4)：51.