高效液相色譜法測定清淋顆粒中大黃素和大黃酚含量

張火旺

(廣東省河源市食品藥品檢驗所，廣東 河源 517000)

清淋顆粒由瞿麥、匾蓄、大黃、關木通、車前子、滑石、梔子、甘草等8味中藥組方，具有清熱瀉火、利水通淋的功效，用于膀胱濕熱所致的淋癥、癃閉，癥見尿頻澀痛、淋瀝不暢、小腹脹滿、口干咽燥等癥。現行標準[1]中，只有梔子苷的含量測定。為確保制劑質量，保證用藥安全有效，選取君藥大黃中的大黃酚和大黃素作為指標性成分進行含量測定研究。筆者采用高效液相色譜(HPLC)法測定了清淋顆粒中大黃素和大黃酚的含量，現報道如下。

1 儀器與試藥

島津LC－2010AHT型高效液相色譜儀；日本島津UV－2450型紫外分光光度計；CP225D型電子天平；SB2200型超聲處理器。甲醇(色譜純，TEDIA)，磷酸(分析純，廣州市番禺力強化工廠)，水為超純水；大黃素對照品(批號為110756－200110)，大黃酚對照品(批號為110796－201017)，供含量測定用，均購自中國食品藥品檢定研究院，含量均為100%；清淋顆粒(市售品)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm)；流動相：甲醇－0.1 mol/L磷酸溶液(85∶15)；檢測波長：254 nm；流速：1.0mL/min；進樣量：20μL。峰面積外標法定量[1]。

2.2 溶液制備

精密稱取經五氧化二磷干燥24 h的大黃素對照品10.25mg，置50mL量瓶中，用無水乙醇－乙酸乙酯(2∶1)溶解至刻度，作為大黃素對照品貯備液；精密稱取經五氧化二磷干燥24 h的大黃酚對照品11.38mg，置25mL量瓶中，用無水乙醇－乙酸乙酯(2∶1)溶解至刻度，作為大黃酚對照品貯備液。各用0.45μm濾膜濾過，即得對照品溶液。取本品，研細(過三號篩)，精密稱取1.0g，置錐形瓶中，精密加乙醇25mL，密塞，稱定質量，置水浴上加熱回流1 h，放冷，用乙醇補足減失的質量，濾過，精密量取續濾液10mL，置燒瓶中，水浴蒸干，加30%乙醇－鹽酸(10∶1)混合溶液15mL，置水浴中加熱回流1 h，立即冷卻，用三氯甲烷強力振搖提取4次，每次15mL，合并三氯甲烷液，置水浴中蒸干，殘渣用無水乙醇－醋酸乙酯(2∶1)溶解，移置25mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續濾液，即得供試品溶液。按其質量標準中處方比例同法制備不含大黃素和大黃酚的陰性樣品，同法制備成陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

干擾試驗：分別取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液，按上述色譜條件進樣。結果兩組分的出峰時間區域沒有干擾的峰，表明處方中其他成分及輔料對樣品的測定無干擾作用。見圖1。

線性關系考察：分別精密量取大黃素對照品貯備液和大黃酚對照品貯備液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL，置100 mL量瓶中，加無水乙醇－醋酸乙酯(2∶1)至刻度并搖勻，配成混合對照品溶液，按上述色譜條件分別進樣20μL，測定峰面積，以峰面積積分值(A)為縱坐標、大黃素與大黃酚對照品質量濃度(C)為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程。大黃素為 A=134 040C+18 017，r=0.999 8；大黃酚為 A=216 687C－26 166，r=0.999 9。結果表明，大黃素與大黃酚的進樣量分別在0.041 0～0.246 0μg和0.091 0～0.546 2μg范圍內與相應的峰面積呈良好線性關系。

圖1 高效液相色譜圖

精密度試驗：取同一混合對照品溶液，連續重復進樣6次，測定峰面積。結果大黃素與大黃酚的 RSD分別為0.9%和1.0% (n=6)，表明儀器具有良好的精密度。

重復性試驗：取同一批樣品，精密稱取6份，按樣品測定方法平行測定兩組分的含量。結果大黃素與大黃酚的 RSD分別為0.43%和0.25%(n=6)。

穩定性試驗：取同一供試品溶液，室溫放置，每隔2h測定1次，連續測定6次。結果大黃素與大黃酚含量的 RSD分別為0.45%和0.26%(n=6)，表明供試品溶液在12 h內測定，穩定性良好。

加樣回收試驗：精密稱取已知含量的樣品(批號為20100801，大黃素含量0.369 5mg/g，大黃酚含量1.024 1mg/g)適量，共6份，分別精密加入用無水乙醇－醋酸乙酯(2∶1)制備的混合對照品溶液1.0，2.0，3.0 mL(大黃素0.11g/L、大黃酚0.26g/L)，水浴加熱將其蒸干。按供試品溶液制備的方法制備，按2.1項下方法分別進樣，記錄色譜圖，計算回收率。結果見表1。

表1 大黃素和大黃酚加樣回收試驗結果(n=6)

2.4 樣品含量測定

取4批樣品，按2.2項下方法制備，進樣，記錄峰面積，按外標法計算含量。結果見表2。根據4批樣品所測結果，暫訂清淋顆粒中大黃素和大黃酚總量定量限為10.0mg/包。

表2 4批樣品含量測定結果(mg/包，n=3)

3 討論

采用高效液相色譜法，在選擇檢測波長時，取大黃酚和大黃素對照品適量，用無水乙醇－醋酸乙酯(2∶1)為溶劑，經紫外－可見分光光度計掃描，大黃酚和大黃素均在254 nm波長處有最大吸收，且大黃酚在254 nm波長處有很大吸收，靈敏度高，故選254 nm作為檢測波長。用所建立的方法測定大黃素和大黃酚的含量，操作簡便、快捷，精密度和準確度都較好。原標準只有梔子苷的含量測定，本法的建立有利于更好地控制藥品質量。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010：1 132，22.