高效液相色譜法測定清淋顆粒中大黃素和大黃酚含量

張火旺

(廣東省河源市食品藥品檢驗所，廣東 河源 517000)

清淋顆粒由瞿麥、匾蓄、大黃、關(guān)木通、車前子、滑石、梔子、甘草等8味中藥組方，具有清熱瀉火、利水通淋的功效，用于膀胱濕熱所致的淋癥、癃閉，癥見尿頻澀痛、淋瀝不暢、小腹脹滿、口干咽燥等癥。現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)[1]中，只有梔子苷的含量測定。為確保制劑質(zhì)量，保證用藥安全有效，選取君藥大黃中的大黃酚和大黃素作為指標(biāo)性成分進(jìn)行含量測定研究。筆者采用高效液相色譜(HPLC)法測定了清淋顆粒中大黃素和大黃酚的含量，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

島津LC－2010AHT型高效液相色譜儀；日本島津UV－2450型紫外分光光度計；CP225D型電子天平；SB2200型超聲處理器。甲醇(色譜純，TEDIA)，磷酸(分析純，廣州市番禺力強(qiáng)化工廠)，水為超純水；大黃素對照品(批號為110756－200110)，大黃酚對照品(批號為110796－201017)，供含量測定用，均購自中國食品藥品檢定研究院，含量均為100%；清淋顆粒(市售品)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm)；流動相：甲醇－0.1 mol/L磷酸溶液(85∶15)；檢測波長：254 nm；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：20μL。峰面積外標(biāo)法定量[1]。

2.2 溶液制備

精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥24 h的大黃素對照品10.25mg，置50mL量瓶中，用無水乙醇－乙酸乙酯(2∶1)溶解至刻度，作為大黃素對照品貯備液；精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥24 h的大黃酚對照品11.38mg，置25mL量瓶中，用無水乙醇－乙酸乙酯(2∶1)溶解至刻度，作為大黃酚對照品貯備液。各用0.45μm濾膜濾過，即得對照品溶液。取本品，研細(xì)(過三號篩)，精密稱取1.0g，置錐形瓶中，精密加乙醇25mL，密塞，稱定質(zhì)量，置水浴上加熱回流1 h，放冷，用乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，精密量取續(xù)濾液10mL，置燒瓶中，水浴蒸干，加30%乙醇－鹽酸(10∶1)混合溶液15mL，置水浴中加熱回流1 h，立即冷卻，用三氯甲烷強(qiáng)力振搖提取4次，每次15mL，合并三氯甲烷液，置水浴中蒸干，殘渣用無水乙醇－醋酸乙酯(2∶1)溶解，移置25mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中處方比例同法制備不含大黃素和大黃酚的陰性樣品，同法制備成陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

干擾試驗：分別取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果兩組分的出峰時間區(qū)域沒有干擾的峰，表明處方中其他成分及輔料對樣品的測定無干擾作用。見圖1。

線性關(guān)系考察：分別精密量取大黃素對照品貯備液和大黃酚對照品貯備液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL，置100 mL量瓶中，加無水乙醇－醋酸乙酯(2∶1)至刻度并搖勻，配成混合對照品溶液，按上述色譜條件分別進(jìn)樣20μL，測定峰面積，以峰面積積分值(A)為縱坐標(biāo)、大黃素與大黃酚對照品質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。大黃素為 A=134 040C+18 017，r=0.999 8；大黃酚為 A=216 687C－26 166，r=0.999 9。結(jié)果表明，大黃素與大黃酚的進(jìn)樣量分別在0.041 0～0.246 0μg和0.091 0～0.546 2μg范圍內(nèi)與相應(yīng)的峰面積呈良好線性關(guān)系。

圖1 高效液相色譜圖

精密度試驗：取同一混合對照品溶液，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積。結(jié)果大黃素與大黃酚的 RSD分別為0.9%和1.0% (n=6)，表明儀器具有良好的精密度。

重復(fù)性試驗：取同一批樣品，精密稱取6份，按樣品測定方法平行測定兩組分的含量。結(jié)果大黃素與大黃酚的 RSD分別為0.43%和0.25%(n=6)。

穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液，室溫放置，每隔2h測定1次，連續(xù)測定6次。結(jié)果大黃素與大黃酚含量的 RSD分別為0.45%和0.26%(n=6)，表明供試品溶液在12 h內(nèi)測定，穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗：精密稱取已知含量的樣品(批號為20100801，大黃素含量0.369 5mg/g，大黃酚含量1.024 1mg/g)適量，共6份，分別精密加入用無水乙醇－醋酸乙酯(2∶1)制備的混合對照品溶液1.0，2.0，3.0 mL(大黃素0.11g/L、大黃酚0.26g/L)，水浴加熱將其蒸干。按供試品溶液制備的方法制備，按2.1項下方法分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 大黃素和大黃酚加樣回收試驗結(jié)果(n=6)

2.4 樣品含量測定

取4批樣品，按2.2項下方法制備，進(jìn)樣，記錄峰面積，按外標(biāo)法計算含量。結(jié)果見表2。根據(jù)4批樣品所測結(jié)果，暫訂清淋顆粒中大黃素和大黃酚總量定量限為10.0mg/包。

表2 4批樣品含量測定結(jié)果(mg/包，n=3)

3 討論

采用高效液相色譜法，在選擇檢測波長時，取大黃酚和大黃素對照品適量，用無水乙醇－醋酸乙酯(2∶1)為溶劑，經(jīng)紫外－可見分光光度計掃描，大黃酚和大黃素均在254 nm波長處有最大吸收，且大黃酚在254 nm波長處有很大吸收，靈敏度高，故選254 nm作為檢測波長。用所建立的方法測定大黃素和大黃酚的含量，操作簡便、快捷，精密度和準(zhǔn)確度都較好。原標(biāo)準(zhǔn)只有梔子苷的含量測定，本法的建立有利于更好地控制藥品質(zhì)量。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：1 132，22.