霍亂弧菌快速檢測(cè)法研究概況

郭 紅

(天津市寧河縣中醫(yī)院，天津301500)

1 細(xì)胞學(xué)方法

1.1 高速離心培養(yǎng)法:傳統(tǒng)的常規(guī)離心培養(yǎng)法檢測(cè)霍亂弧菌的特異性和靈敏程度均較高，但是需要的時(shí)間較長(zhǎng)，初步得到報(bào)告的時(shí)間至少在30 h以上。另外，若標(biāo)本中霍亂弧菌的數(shù)量少，其檢驗(yàn)結(jié)果長(zhǎng)呈現(xiàn)陰性，給實(shí)際工作增添了一定的難度。黃紅瑩等［4］在傳統(tǒng)的分離方法基礎(chǔ)上通過高速離心技術(shù)使標(biāo)本中霍亂弧菌的數(shù)量相對(duì)的增加，以達(dá)到快速檢測(cè)的目的。該方法采用高速離心(6 000 r/min)取其沉淀物接種普通瓊脂平板37℃培養(yǎng)，一般菌落出現(xiàn)時(shí)間在8 h左右，使檢出的陽(yáng)性結(jié)果能在10 h內(nèi)發(fā)出報(bào)告，比常規(guī)檢測(cè)方法快，而陽(yáng)性檢出率也有較大程度的提高。

1.2 免疫學(xué)方法

1.2.1 血清學(xué)方法:免疫學(xué)方法普遍認(rèn)為特異性強(qiáng)、靈敏度高、易于觀察、應(yīng)用范圍廣。血清學(xué)方法是最基本的免疫學(xué)方法，主要用于細(xì)菌的分型。目前，根據(jù)菌體抗原的不同，將霍亂弧菌分為200多個(gè)血清群［5］，只有O1群的古典生物型、埃爾托生物群和O139群能引起大流行。正確的血清分型可為流行病學(xué)調(diào)查、診斷及臨床用藥提供科學(xué)的依據(jù)。但此方法就目前所分離出的血清群認(rèn)為有局限性，若出現(xiàn)新的血清型時(shí)以現(xiàn)在僅有的血清檢測(cè)易出現(xiàn)漏檢。

1.2.2 改良免疫熒光菌球法:改良免疫熒光菌球法［6－7］是在免疫熒光菌球法的基礎(chǔ)上秉承其敏感性高、抗干擾能力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，還可同時(shí)檢測(cè)外環(huán)境水體和水產(chǎn)品中的O1和O139霍亂弧菌，可避免常規(guī)法對(duì)檢測(cè)O139霍亂弧菌(特別是產(chǎn)毒株)的漏檢，是目前霍亂外環(huán)境監(jiān)測(cè)的首選方法之一。但要求樣品中菌濃度在9 cfu/mL以上，若標(biāo)本中霍亂弧菌量少時(shí)常呈陰性檢測(cè)結(jié)果，因此需要增菌培養(yǎng)6～8 h后在鏡檢，操作較為繁瑣，試驗(yàn)結(jié)果又不穩(wěn)定。

1.2.3 膠體金免疫層析法:膠體金免疫層析法特異性高，靈敏度好，不僅能檢測(cè)活菌，還能檢測(cè)死菌。謝昭聰?shù)龋?］用此方法對(duì)水產(chǎn)品中的霍亂弧菌的快速檢測(cè)進(jìn)行了研究。應(yīng)用該方法進(jìn)行檢測(cè)，陰性者可直接報(bào)告，陽(yáng)性者則參照《霍亂防治手冊(cè)》進(jìn)一步分離鑒定，因?yàn)槟壳拔覈?guó)對(duì)霍亂弧菌的膠體金免疫層析法還沒有具體的標(biāo)準(zhǔn)，仍以細(xì)菌培養(yǎng)法為核心，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)血清凝集試驗(yàn)鑒定出抗原為依據(jù)。該法假陽(yáng)性率較高(8%)只能作為初篩試驗(yàn)。

1.2.4 霍亂弧菌快速檢測(cè)試紙條:O139霍亂弧菌快速檢測(cè)試紙條是結(jié)合特異性單克隆抗體技術(shù)和免疫膠體金技術(shù)研制出的一種新方法。鄧志紅等［2］為該試紙條的臨床效果作了評(píng)價(jià)。其檢測(cè)十分簡(jiǎn)捷，5～10 min內(nèi)即出結(jié)果，結(jié)果清晰容易判定，靈敏度高，特異性強(qiáng)，并且不需要任何設(shè)備，沒有特殊的實(shí)驗(yàn)室條件要求，適合基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)腹瀉門診病人的O139霍亂監(jiān)測(cè)。但該方法陽(yáng)性預(yù)測(cè)值低(46.67%)，不能取代常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)，只能作為一種篩檢方法使用，最終的確診仍以細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果為準(zhǔn)。

2 分子生物學(xué)方法

2.1 脈沖場(chǎng)電泳:脈沖場(chǎng)電泳是近幾年發(fā)展起來的分子生物學(xué)技術(shù)，這一技術(shù)可將50 Kb以上或幾千Kb的DNA大片段進(jìn)行有效的分離，解決了一般瓊脂糖電泳不能實(shí)現(xiàn)的技術(shù)難點(diǎn)。該法可將大片的DNA采用內(nèi)切酶切割進(jìn)行有效的分離，不同來源的菌株可產(chǎn)生不同的電泳圖譜，進(jìn)而對(duì)霍亂弧菌不同血清型之間的基因組差異進(jìn)行分析，這一技術(shù)近年來在霍亂分子流行病學(xué)研究中已得到應(yīng)用。丁建清等［8］應(yīng)用此技術(shù)對(duì)從霍亂患者和外環(huán)境水體中分離出的20株霍亂弧菌進(jìn)行了基因分型，顯示菌株之間其脈沖場(chǎng)電泳圖譜有較大差異，基因片段位置及大小也不等，提示存在多態(tài)性。

2.2 PCR方法PCR受試劑盒、設(shè)備、試劑等條件的限制，基層單位很難展開，現(xiàn)僅對(duì)普通一對(duì)引物PCR、多重PCR做一簡(jiǎn)單介紹。

2.2.1 普通一對(duì)引物PCR該法只設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物。丁建清等［9］根據(jù)Bisweswar報(bào)道的霍亂弧菌編碼外膜蛋白o(hù)mpw基因合成一對(duì)外膜蛋白引物，采用PCR法對(duì)天津市海河水系非O1群霍亂弧菌感染狀況進(jìn)行了檢測(cè)。102份水樣PCR檢測(cè)總陽(yáng)性率為52%，擴(kuò)增片段588bp，與常規(guī)分離培養(yǎng)比較，符合率為100%。霍亂弧菌外膜蛋白引物快速檢測(cè)海河水系非O1群霍亂弧菌敏感性高，特異性強(qiáng)，可提高檢測(cè)速度四五倍，為非O1群霍亂的防治提供了一種有用的檢測(cè)手段。

2.2.2 多重PCR:多重PCR是同時(shí)用一種以上引物對(duì)在同一反應(yīng)管中同時(shí)擴(kuò)增出多條目的DNA片段，簡(jiǎn)捷，快速，靈敏，特異性高。井良義等［10］將針對(duì)霍亂弧菌腸毒素A亞單位基因(ctxA)、小帶聯(lián)結(jié)毒素基因(zot)、輔助霍亂弧菌腸毒素基因(ace)、霍亂弧菌毒素共調(diào)菌毛A基因(tcpA)、毒素表達(dá)調(diào)控蛋白基因(toxR)的5對(duì)特異引物進(jìn)行多重PCR，可快速、敏感地檢測(cè)霍亂弧菌O1群、O139、非O1群/非O139群的毒素相關(guān)基因。井良義等［11］將對(duì)ctxA、RTX毒素家族的細(xì)胞毒素基因(rtxA)和毒素激活基因(rtxC)的3對(duì)引物進(jìn)行多重PCR，可快速、敏感地檢測(cè)霍亂弧菌RTX毒力基因。金慧英等［12］建立了同時(shí)檢測(cè)腸出血性大腸埃希菌(O157:H7)和霍亂弧菌的多重PCR方法，首先選擇O157:H7的O抗原(rfbE)、H抗原(fliC)基因以及霍亂弧菌外膜蛋白(ompw)基因和ctxA特異的4對(duì)引物，共同對(duì)O157:H7和霍亂弧菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并以瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，可出現(xiàn)4單一條帶。該方法可對(duì)O157:H7和霍亂弧菌進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)。芮勇宇等［13］分別針對(duì)ctxA、O139群基因和tcpA設(shè)計(jì)引物，建立了可檢測(cè)和區(qū)分霍亂弧菌O1群古典型、埃爾托型、O139群和非O1、非O139群的多基因PCR方法。許龍巖等［14］以霍亂弧菌O139特異基因(T139)、ctxA、tcpA、副溶血性弧菌熱穩(wěn)定性直接溶血素基因(tdh)為靶序列，建立了可同時(shí)檢測(cè)食品中O1群、O139群霍亂弧菌和副溶血性弧菌的多重PCR方法。該方法整個(gè)過程7～10小時(shí)完成，是一種敏感、省時(shí)、省力的檢測(cè)方法。

PCR雖然有極高靈敏度，也有很強(qiáng)的特異性，而且快速方便，但成本高，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，且需要PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)等，它的廣泛使用受到一定的限制［15］。

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)理論與技術(shù)的發(fā)展以及新儀器的研發(fā)，霍亂弧菌的檢測(cè)方法必將向快速、準(zhǔn)確、靈敏的方向發(fā)展，大大提高檢驗(yàn)檢疫和臨床診斷的檢測(cè)質(zhì)量和效率。

［1］ 李麗娟，霍亂弧菌的檢測(cè)研究進(jìn)展［J］.實(shí)用醫(yī)技雜志，2007，11(4):523 －525.

［2］ 鄧志紅，胡世雄，曾亞雄，等.O139霍亂弧菌快速檢測(cè)試紙條臨床效果評(píng)價(jià)［J］.實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2007，11，(5):973－974.

［3］ 李士紅.對(duì)1例非典型霍亂患者病原菌的實(shí)驗(yàn)鑒定［J］.中國(guó)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2008，6(1):74.

［4］ 黃紅瑩，許國(guó)強(qiáng)，霍亂弧菌快速檢測(cè)法探討［J］.河南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2007，23(4):22.

［5］ 丁靜秋，劉延清，陳亢川，等.霍亂防治手冊(cè)［M］.5版，北京:中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部疾病控制司，2008:35.

［6］ 許學(xué)斌，顧寶柯，胡培，等.改良免疫熒光菌球法檢測(cè)外環(huán)境中O1和O139群霍亂弧菌效果的探討［J］.中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2008，4(3):204 －206.

［7］ 謝邵聰，宋志強(qiáng)，呂敬章，等.應(yīng)用膠體金免疫層析法檢測(cè)水產(chǎn)品中霍亂弧菌的研究［J］.中國(guó)國(guó)境衛(wèi)生檢疫雜志，2008，28(3):163－165.

［8］ 丁建清，董杰，王書梅，等.脈沖場(chǎng)電泳在霍亂弧菌分型中的應(yīng)用［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2005，15(7):790－791.

［9］ 丁建清，王書梅，田勇琴，等.PCR快速測(cè)定法在檢測(cè)海河水體非O1群霍亂弧菌中的應(yīng)用［J］.環(huán)境與健康雜志，2007，19(6):438－440.

［10］ 井良義，陳錦英，王書梅，等.多重PCR檢測(cè)霍亂弧菌的毒素相關(guān)基因［J］.環(huán)境與健康雜志，2007，20(6):361－371.

［11］ 井良義，陳錦英，王書梅，等.多重PCR檢測(cè)霍亂弧菌RTX毒力基因［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2007，15(9):1039－1041.

［12］ 金慧英，陳華標(biāo)，陶開華，等.腸出血性大腸埃希氏菌 O157:H7和霍亂弧菌的多重PCR檢測(cè)［J］.解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2008，21(4):252 －255.

［13］ 芮勇宇，蔡初的，蕭斌權(quán)，等.勇多基因PCR檢測(cè)和區(qū)分不同群型霍亂病原菌［J］.中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2007，34(5):278－280.

［14］ 許龍巖，周宏斌，高東微，等.MPCR檢測(cè)食品中霍亂弧菌和副溶血性弧菌的研究［J］.衛(wèi)生研究，2007，34(1):115－117.

［15］ 王艷玲，霍亂弧菌快速檢測(cè)法研究進(jìn)展［J］.職業(yè)與健康，2007，23(18):1656 －1657.