腫瘤細胞體外藥敏試驗臨床研究進展

段國辰 杜錦波 牛占叢

惡性腫瘤是目前危害人類健康最嚴重的一類疾病，近年來其發病率和病死率都有明顯的增高趨勢［1］。惡性腫瘤治療包括手術治療、放射治療、化學治療和生物治療。其中化療可以殺死血液里的腫瘤細胞，作為全身治療已成為腫瘤治療的不可替代的方法。但化療存在主要問題是腫瘤細胞對化療藥物不敏感，抗癌藥物的毒副作用。目前臨床使用的抗癌藥物均有不同程度的毒副作用，這是目前由于抗癌藥物對腫瘤細胞的選擇性不強，在殺傷腫瘤細胞的同時對正常組織細胞也有損傷作用，產生毒副作用。這些是腫瘤化療失敗的主要原因，也是腫瘤化療急需解決的難題。在化療前準確選用有效的化療藥物進行個體化療是解決這一難題的根本途徑。因此進行抗腫瘤藥物敏感試驗已成為當今癌癥研究的主攻課題之一，多年來人們一直努力尋找簡便、準確、又切實可行的藥物敏感實驗，本文旨在通過個體化療，提高療效，減少毒副作用。就腫瘤體外藥敏實驗臨床研究進展作一綜述。

1 腫瘤細胞體外藥敏實驗的意義

化療在惡性腫瘤以手術為主的綜合治療中占有重要地位，其在惡性腫瘤的治療中越來越受到重視。化療為全身治療，可以有效的殺死腫瘤細胞，提高遠期生存率及生活質量。但目前術前和術后的化療也逐漸顯露出很多問題:術前化療有可能無法取得患者的病理類型、術后患者雖然取得確切的病理類型然而個體間存在明顯的差異性，相同病理類型的患者對同一種化療藥物的敏感性不同，這些因素都可能影響治療效果。目前的經典化療方案來源于大樣本、多地區的統計資料，缺乏個體化。有些腫瘤患者病理類型甚至臨床分期都相同，卻對化療藥物的敏感性有很大的不同，使得這些患者的療效和生活質量存在較大的差異性。目前，應用腫瘤的原代細胞對臨床常用的化療藥物做體外藥敏試驗進而指導腫瘤患者的個體化化療的研究越來越受到重視［2，3］。不論術前、術后，腫瘤原代細胞的藥物敏感性研究都將為患者個體化化療提供實驗依據和理論指導。日本衛生部早在1999年就將腫瘤藥敏試驗正式批準為一種“先進的臨床醫學技術”在各大醫院中廣泛的應用，此后藥敏實驗在日本得到了迅猛的發展［4］。Nakamura等［5］做了大量的胃癌患者的原代細胞對化療藥物的敏感實驗，以胃癌患者的3年生存率作為判斷指標，最后得出胃癌患者的腫瘤原代細胞化療藥物敏感組的3年生存率比傳統化療組、和不接受化療組的明顯提高。檢測藥物敏感性有很多方法，其中四氮唑鹽(MTT)比色法是一種為腫瘤患者篩選化療藥物的經典方法，它使用了96孔板使得操作半自動化，使得整個實驗過程簡單、快速、能夠處理大樣本，減少因操作時間長而導致的可能污染［6］。MTT法被廣泛用于腫瘤細胞的抗癌藥物敏感實驗及其篩選最佳的化療藥物組合為個體化化療提供實驗基礎［7］，在很大程度上避免耐藥性的發生，減少了盲目性用藥，減少了腫瘤的復發和遠處轉移，提高了5年生存率［8］。MTT比色分析法為腫瘤患者的個體化化療提供了一條可行的、有效的、精確的實驗手段。MTT比色分析法能夠用于人體多種腫瘤細胞，其應用范圍十分廣泛。早在20世紀80年代初已經采用MTT法作為急性白血病臨床篩選化療藥物的實驗依據，并且療效顯著。直腸癌原代細胞進行MTT比色分析法得出的最佳化療組合與臨床經典的化療方案不完全一致，MTT敏感組的近期臨床有效率及3年生存率明顯高于對照組與MTT不敏感組。不同化療方案對同一個肝癌患者的療效不同，即敏感性有顯著差異。不同的肝癌患者雖然病理類型，臨床分期相同但對同一種化療藥物的敏感性亦不同。應用MTT敏感的化療藥物其臨床緩解率明顯高于經典化療方案對肝癌患者的緩解率。有報道:已將MTT藥敏試驗作為臨床腦腫瘤化療藥物篩選的一種可靠方法［9］。劉毅等［10］以MTT比色分析法結合流式細胞儀分別檢測細胞抑制率和細胞凋亡率，以這兩個指標為基礎篩選出適合患者的化療藥物，避免了用藥的盲目性，避免了耐藥性的發生，使卵巢癌患者的緩解率較經驗化療組明顯提高。因此通過MTT比色分析法來進行原代細胞的藥物敏感試驗將對化療藥物的選擇提供實驗手段，并且能夠幫助預測患者的預后，為患者遠期療效提供實驗指導［8］。總之，將體外藥敏實驗技術應用于腫瘤患者的化療將大幅提高患者的生活質量和遠期存活率。然而MTT比色分析法在實際應用中仍然面臨著諸多問題:首先MTT法在應用中尚未形成一套嚴格的實驗標準，各國、各研究人員依靠著不同的實驗依據而采用的化療藥物濃度、MTT濃度、腫瘤原代細胞的濃度、化療藥物與腫瘤細胞作用時間、MTT與腫瘤細胞作用時間等關鍵性的步驟均有所不同，在很大程度上限制了MTT法的臨床應用，不利于各研究機構的實驗結果比較。魏文清等［11］經過研究證實:不同系統的腫瘤、應該采用不同的細胞濃度。腫瘤細胞與化療藥物的作用時間一般以48 h為宜。MTT與腫瘤細胞作用時間以6 h為宜。在這樣的條件下，實驗效果較好。所以MTT比色分析法仍需要發展與完善，使其能夠更加科學的應用于腫瘤患者的個體化化學治療中，從而最大程度的發揮其不可替代的作用，應推廣腫瘤原代細胞藥敏技術、并將其規范化、標準化，其對臨床有著無可估量的應用價值，能夠篩選出完全適合患者的化療藥物，對傳統化療藥物的改革、新藥的開發與應用都有著非常重要的實際意義，也為腫瘤患者的個體化治療提供理論依據，對腫瘤患者的個體化治療具有重要的意義［12，13］。

2 外周血淋巴細胞替代腫瘤細胞行體外藥敏試驗的可行性

臨床上經常遇到以下問題:由于各種原因無法取得腫瘤標本;隨著化療次數的增加敏感藥物可能也會有所改變;腫瘤細胞難以純化、非腫瘤成分多容易干擾藥敏結果;腫瘤組織污染較重，明顯影響藥敏結果，上述情況臨床上又需要及時、準確的獲得藥敏實驗數據。有研究證實，不同患者對化療藥物所表現出的敏感性差異與其遺傳有很大關系，同一個體的不同體細胞與突變的腫瘤細胞在基因組上是完全相同的，外周靜脈血淋巴細胞同腫瘤細胞一樣具有耐藥基因的表達［14］。盡管由于不同條件的存在使得具有相同基因組的不同細胞、不同組織在生物特性上有著較為明顯的差異，但面對相同外界打擊的條件下，所表現出的抗打擊反應潛能是相似的［15］。所以用腫瘤患者外周靜脈血淋巴細胞替代腫瘤細胞進行藥物敏感試驗來篩選化療藥物在理論上是可行的。艾軍等［16］報道:外周靜脈血淋巴細胞同腫瘤細胞在體外對同一種化療藥物在敏感性上具有良好的一致性，并且這兩種細胞在抗癌藥物作用下所表現出的平均抑制率為正相關。王艷萍等［17］以MTT方法為基礎測定了74例肺癌患者癌細胞及其自身外周血淋巴細胞對臨床上常用的15種化療藥物的敏感性，結果肺癌細胞與自身外周血淋巴細胞對其中12種化療藥物的敏感性有著良好的正相關性，且有統計學意義。袁淑蘭等［18］通過MTT法檢測神經膠質瘤患者腫瘤細胞和外周血淋巴細胞對臨床常用化療藥物的敏感性，結果為腫瘤細胞與自身外周血淋巴細胞對化療藥物的敏感性有良好的正相關性。所以對于由于失去手術機會，無法獲得腫瘤組織的患者，或多次化療可能產生耐藥性的患者，用其外周靜脈血淋巴細胞代替腫瘤細胞進行化療藥物的藥敏試驗，進而對化療藥物篩選是可行的。

3 腫瘤細胞體外藥敏差異性的可能發生機制

相同病理類型的患者對同一種化療藥物的藥物敏感性差異與其耐藥相關蛋白的表達水平有很大的關系。鉑類藥物(包括順鉑、卡鉑等)是非小細胞肺癌化學治療中最常用的藥物之一，它通過與DNA結合，形成鉑-DNA加合物從而導致DNA的交鏈反應，進而干擾DNA轉錄和復制，通過此機制來抑制腫瘤細胞的分裂、生長起到殺死腫瘤細胞的作用。研究證實切除修復交叉互補基因1(excision repair cross-complementation group 1，ERCC1)在人類多種臟器惡性腫瘤細胞中均有表達［19，20］，ERCC1的表達水平與鉑類化療敏感性的差異關系緊密，ERCC1可以修復化療藥物鉑類導致的DNA損傷，從而進一步致使腫瘤對鉑類的耐藥，ERCC1高表達者會導致鉑類耐藥，所以ERCC1可較好的作為鉑類化學治療敏感性的預測基因［21］。Olaussen等［22］對761個非小細胞肺癌患者的腫瘤組織進行ERCC1的檢測，并進行鉑類藥物的化學治療，結果發現:ERCC1表達陰性的患者較陽性患者對鉑類藥物敏感。近來也有報道，ERCC1的表達與腫瘤細胞對鉑類的耐藥有關［23］。

肺癌耐藥蛋白(lung cancer resistance protein，LRP)，在形成NSCLC的耐藥機制中受到越來越多的重視。LRP是腫瘤多藥耐藥(multi-drug resistance，MDR)性中的一個重要蛋白。LRP蛋白被國內外很多專家認為可以預測化療敏感性［24］。LRP蛋白的作用機制與藥物的外排作用和溶酶體的作用有關。通過藥物外排作用而很大程度上減少化療藥物的積累，以降低化療藥物的絕對濃度。另外LRP對細胞核、細胞質的運輸有重要作用，它通過改變化療藥物在細胞核、細胞質中的分布比例，而達到降低藥物的有效作用濃度。通過以上作用機理導致腫瘤細胞內有效的化療藥物濃度下降，當化療藥物濃度低于治療濃度的閾值便會進而引起耐藥性的發生。很多研究證實LRP的表達與腫瘤的病理類型有關，一般為LRP在腺癌中的表達水平明顯高于鱗癌，但LRP的表達水平與性別，年齡、是否抽煙、腫瘤分化程度、淋巴結有無轉移無相關性［25，26］。人類多種臟器腫瘤中均有LRP的表達，并且LRP的表達水平和這些腫瘤對化療藥物的敏感性差異緊密相關，LRP在腫瘤組織中高表達者化療療效差，預后也較低表達者差［27－29］。Berger等［30］對 16 例非小細胞肺癌進行體外研究證實，LRP蛋白表達陽性的肺癌細胞耐藥性強，對化療藥物不敏感。LRP蛋白為人類穹隆體主蛋白，通過藥物的外排作用導致細胞對許多化療藥產生耐藥性，如絲裂霉素、烷化劑和順鉑等［30］。

胸苷磷酸化酶(Thymidine phosphorylase，TP)是一種由2條多肽鏈所構成的二聚體，TP與腫瘤的化學治療有著緊密的關系，它能增強腫瘤細胞對5-氟尿嘧啶(5-Fu)的敏感性，提高化療效果，從而改善患者的預后。TP的表達水平與腫瘤內的微血管密度有良好的正相關性。TP一般表達于細胞膜，而且周圍正常組織內TP的密度明顯低于腫瘤組織內的密度。研究認為TP是嘧啶核苷代謝過程中的一個關鍵酶，TP能夠催化5-Fu前體藥在腫瘤細胞內的激活，從而提高腫瘤細胞內的5-Fu的濃度，從而增加5-Fu的化學治療效果。腫瘤細胞內高TP活性能保持細胞內5-Fu的高濃度從而才能最大程度的抑制腫瘤［31］。Meropol等［32］通過免疫組織化學染色技術將直腸癌中TP的表達水平與化療敏感性和生存期之間的關系進行了統計分析，結果證實，TP的表達水平同化療敏感性和生存期均有明顯正相關性，即TP表達水平越高則對化學治療越敏感、生存期也就越長，預后也就越好。所以檢測腫瘤中TP表達水平可以很好的預測化療是否有效。而且也有研究證實:TP表達水平與腫瘤的轉移及患者的預后有關系［33］。但關于TP表達水平與預后的關系也有不一致的報道。惡性腫瘤的生長是伴隨新生血管的生長而生長的。在沒有新的血供條件下，一般腫瘤只能長到2mm3左右。新生血管往往是不連續的，發育也不完全，很多新生的血管基底膜也不完整，腫瘤的轉移很可能是通過不完整的血管基底膜進入血液循環的。在非小細胞肺癌、胃癌等許多腫瘤中TP的表達水平與腫瘤自身的微血管的形成有著密切關系［34］。目前也有研究證實TP表達越強則腫瘤的侵襲性越強，預后也越差。

綜上所述，腫瘤的體外藥敏實驗能夠很好地指導臨床工作，外周血淋巴細胞與腫瘤細胞在體外藥物敏感性上有著良好的正相關性。當由于各種原因無法獲得腫瘤細胞時，可以用淋巴細胞來替代腫瘤細胞進行體外藥物敏感試驗從而有針對性的選擇化療藥物。但體外藥物敏感試驗仍有不足之處，體外實驗無法考慮細胞毒性，無法科學的評估化療藥物對人體正常細胞的作用。體外藥敏試驗只是偏重于腫瘤細胞的個體化，但體外和體內還存在許多差異。體內藥物主要通過肝、腎來修飾和代謝，另外體內還有一定的內環境，這些因素均可能改變藥物的療效，而體外實驗則藥物直接作用于細胞，無法真正模擬體內環境。腫瘤細胞具有異質性，隨著腫瘤的發生、發展，藥物的敏感性可能會有改變。ERCC1、LRP、TP在NSCLC耐藥性的產生、化學治療的療效及預后等方面具有重要的參考價值。不同患者耐藥相關蛋白表達水平的差異導致了即時具有相同病理類型的腫瘤細胞對同一種化療藥物的敏感性具有很大的差異性。然而耐藥相關蛋白的調控機制十分復雜，各國、各研究機構對于耐藥相關蛋白如何產生耐藥性的機制仍不十分明確。耐藥相關蛋白是否有協同作用也不清楚，需要更多的致力于體外藥敏實驗的研究，并找到藥敏差異性的分子機制，這樣才能更好地為腫瘤患者的個體化治療提供理論指導。

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