EDTA抗凝和加熱滅活補體對血型血清學試驗的影響

張敬 楊君青 史國爽

鹽水法交叉配血和ABO反定型，是紅細胞血型血清學的經典常規試驗，因操作方便和迅速，為搶救患者爭取了時間，可檢出臨床意義最大的ABO血型抗體，其試驗結果的準確性常影響到受血者的生命安全，因意義重大深受臨床關注。在實際工作中發現，如果因某種原因延長了孵育時間，有些標本的ABO抗體與相應抗原紅細胞結合后會激活補體，導致溶血、凝集強度減弱，甚至呈假陰性結果，嚴重干擾血型血清學試驗結果的正確報告［1］。為找到簡單有效地消除血型血清學試驗中補體激活導致溶血等干擾現象的方法，筆者進行了大量的試驗。本文探討EDTA抗凝和傳統血清56℃加熱法對補體滅活及對血型血清學試驗的影響，報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料 選擇來我站329名健康獻血者，每份標本各留2管，其中一管按照EDTA真空抗凝管抗凝能力留取一定量的血樣于抗凝管中，另一管不加任何抗凝劑。留樣后放于4℃冰箱，10 h內檢測完畢。

1.2 儀器與試劑 KA-2200小型臺式離心機(日本久保田公司);抗人球蛋白試劑多特異性(抗IgG、C3)，單特異性(抗IgG)，單特異性(抗C3)均為上海血液生物醫藥有限責任公司產品;抗A、抗B單克隆標準抗血清由長春博德生物技術有限責任公司提供(批批檢合格，有效期內使用);EDTA抗凝真空管江西洪達醫療器械集團有限公司產品，抗凝能力2 ml全血。

1.3 紅細胞懸液 A型和B型獻血員各3名的紅細胞，等量混合后洗滌3遍，分別用0.9%氯化鈉溶液配成3% ～5% 濃度懸液。

1.4 方法 (1)試管法ABO血型定型、直接抗球蛋白試驗、效價測定。(2)血清56℃加熱滅活處理:將血清置56℃水浴箱，孵育30 min，再進行ABO反定型試驗。(3)溶血反應判定標準:抗-A或抗-B與對應抗原紅細胞結合后，凡出現肉眼可見的溶血者，均判定為出現免疫性溶血反應。

2 結果

2.1 血型正定型 以試管法對329份標本進行ABO正定型，結果A型95份，B型108份，O型90份，AB型36份，均未出現溶血反應，陽性反應的凝集強度都是++++。

2.2 血清反定型

2.2.1 被檢血清2滴加紅細胞懸液1滴混合，室溫孵育10 min后離心看結果。共14例血清出現溶血占4.26%，其中A型4例、B型3例、O型7例;溶血標本的紅細胞凝集強度明顯減弱(+～++)。在出現溶血反應的7例O型標本中有5例血清與A型和B型紅細胞均呈溶血反應，其余2例血清有1例與A型紅細胞呈溶血反應B型紅細胞不溶血呈強凝集，另外1例僅與B型紅細胞呈溶血反應，而與A型紅細胞不溶血呈強凝集。

2.2.2 EDTA抗凝血漿2滴加紅細胞懸液1滴混合室溫孵育10 min后離心看結果，所有標本管均未見溶血，凝集強度均≥3+。

2.2.3 取室溫出現溶血反應的血清各 1 ml，放56℃ 水浴30 min滅活補體，補體滅活后血清2滴加紅細胞懸液1滴混合室溫孵育10 min后離心看結果，有一管有輕微溶血，其余未見溶血，凝集強度均≥+++。

2.2.4 效價測定:所有出現溶血反應的14例標本分別測定血清、EDTA抗凝血漿和56℃滅活血清的抗-A和(或)抗-B效價。結果56℃孵育后，抗-A(B)效價，下降2個滴度5管，下降1個滴度9管，效價未下降者7管;EDTA抗凝血漿效價基本與血清一致。

2.3 直接抗球蛋白試驗 所有14例標本直接抗球蛋白試驗多特異性(抗IgG、C3)、單特異性(抗IgG)、單特異性(抗C3)均為陰性。

3 討論

在ABO反定型試驗出現溶血反應的標本中O型血清出現溶血的比例最高且最嚴重，這可能是由于O型血清中既有抗-A，又有抗-B，且抗體效價相對較高的緣故。溶血標本的紅細胞凝集強度明顯減弱［1］。

抗-A(B)溶血活性隨孵育時間和溫度升高而增強，它能造成紅細胞弱凝集、溶血甚至假陰性，嚴重干擾血型血清學試驗結果的判定。確保立即離心能從一定程度上避免激活補體，但日常試驗中由于種種原因耽誤離心，延長了紅細胞與血清孵育時間，容易激活補體引起溶血。

補體對溫度有一定的敏感性，56℃加熱30 min是經典的補體滅活方法，但是本文試驗表明，大批標本時該方法不僅操作繁瑣、時間長，而且可能會有少數標本中補體不能被全部滅活，過高的孵育溫度還可能導致低濃度弱抗體活性喪失而檢不出。筆者認為以往傳統血清加熱滅活補體的方法敏感性低，操作繁瑣，不宜常規使用。

血型血清學試驗中補體的激活需鈣、鎂離子參加，因此國外用EDTA鉀鹽溶液絡合鈣、鎂離子，消除溶血的干擾［2，3］。目前該法已常規用地交叉配血。EDTA不僅防止補體激活，還可以防止高效價抗-A(B)在ABO反定型時出現前帶現象(不凝集，即假陰性)［2］。從本實驗的結果來看EDTA對血清中的抗體效價沒有影響，所以EDTA抗凝血適合用于進行ABO反定型或交叉配血

綜上所述，建議用于血型和配血試驗的標本常規的采用EDTA抗凝管采血。由于條件所限不能用EDTA抗凝者如發現有因溶血造成的正反定型不符，將血清放56℃滅活補體也可，但要注意溫度和時間，以免血清中抗體失活。

1 孫愛農，鮑自謙，曹鐵源.紅細胞血型血清學試驗中溶血現象的消除.現代檢驗醫學雜志，2002，17:20.

2 Judd WJ，Steiner EA，O’Donnell DB，et al.Discrepancies in reverse ABO typing due to prozone.How safe is the immediccte-spin crossmatch.Tranfuion，1988，28:334-338.

3 Shulman IA，Calderon C.Effect of delayed centrifugation or reading on the detection of ABC ineompatibility by the immediate-spin crossmatch.Tranfuion，1991，31:197-200.