量子點分子信標的制備及其在核酸檢測中的應用

賈滬寧，葉寶芬，嚴拯宇

（中國藥科大學分析化學教研室，江蘇 南京 210009）

進展與述評

量子點分子信標的制備及其在核酸檢測中的應用

賈滬寧，葉寶芬，嚴拯宇

（中國藥科大學分析化學教研室，江蘇 南京 210009）

量子點具有耐光漂白、顏色可調、一元激發/多元發射以及發射光譜窄等特性，故將其應用在分子信標中，必將克服傳統有機染料的很多缺點。量子點分子信標不但靈敏度高、光穩定性好，而且可以進行多重檢測。本文就近幾年來量子點分子信標的發展進行了綜述，其中針對量子點的制備系統闡述了可用于制備分子信標的量子點類型、量子點與分子信標連接的方式、量子點分子信標猝滅劑的選擇及其表征。同時還詳細介紹了量子點分子信標在多重SNP測定、細胞內病毒表達等核酸檢測中的應用。

量子點；分子信標；核酸檢測；制備

1996年，Tyagi和 Kramer[1]設計了一種可以特異性識別核酸序列的新型熒光探針——分子信標（Molecular Beacon）。這種探針是由寡核苷酸形成的發夾型分子，它包括一個環-莖結構。其中環由與靶分子互補的核酸堿基序列組成，一般有 15～20個堿基；莖為兩列互補的堿基序列，一般是 5～7個堿基對。分子信標5＇端帶有熒光基團，3＇端帶有猝滅基團。沒有靶分子時，分子信標的熒光基團與淬滅基團距離很近，熒光基團不發光；當分子信標與序列互補的靶分子結合時，環與靶序列發生雜交，莖部分被打開，使熒光基團遠離淬滅基團，從而恢復熒光。分子信標具有特異性強、可實時檢測等優點，得到了很好的發展[2-4]。然而傳統的分子信標使用的熒光基團大都為有機熒光染料，其光漂白性和染料顏色的單一性，限制了分子信標更為廣泛的應用[5]。

量子點（quantum dots，QDs）又稱半導體納米晶體（semiconductor nanocrystal），是一種由Ⅱ～Ⅵ族（如CdSe、CdTe、CdS、ZnSe等）或Ⅲ～Ⅴ族（如InP、InAs等）元素組成，能夠接受激發光產生熒光的半導體納米粒子[6]。量子點一般直徑為1～10 nm，由于限域效應，其原有的連續能帶結構發生分立、量子化，從而使其物理、化學及光學性質都產生了明顯的變化[6]。熒光量子點因其獨特的抗光降解、顏色可變、一元激發/多元發射及發射波長可調等特性，可以彌補有機染料修飾的傳統探針的一些缺陷，所以被用來設計新型的分子信標[7-9]。本文作者就將對量子點分子信標的制備及其在核酸檢測中的應用，尤其是近幾年的進展進行介紹。

1 量子點分子信標的制備

1.1 用于制備分子信標量子點的類型

在分子信標中可以作為能量轉移信號供體的量子點一般為CdTe量子點[10-12]和ZnS-CdSe核殼量子點[13-14]。在密閉體系中，用高純氮氣脫氧、保護，用巰基乙酸（TGA）作穩定劑，用1 mol/L NaOH調節pH值，得到量子點前體溶液；加入新制備好的NaHTe到前體溶液中；在96 ℃水浴中回流2 h，即可得到尺度均一的水溶性CdTe[10]。ZnS-CdSe核殼量子點最早由Hines等報道[15]，由于量子點表面包覆一層 ZnS顯著提高了量子點的量子產率。Dabbousi等[16]在此基礎上，將其制備好的單分散的CdSe納米顆粒表面包覆了一層ZnS，將其量子產率提高到30%～50%。這些量子點具有水溶性較好、制備方法成熟、性質穩定的特點，是制備量子點分子信標的常用材料。

然而在比較苛刻的條件中（如pH值較低時），這些普通的量子點會變得不穩定而影響其檢測效果。針對這一問題，研制了硅包裹量子點的分子信標[17]。通過將傳統方法制備的三辛基氧膦修飾的ZnS-CdSe量子點與巰基乙醇反應得到羥基修飾的量子點。純化后再與氨丙基三甲氧基硅烷反應得到氨基修飾的硅烷化量子點。將此產物進一步與琥珀酰酐反應便得到了羧基修飾的硅烷化量子點。與其它的硅量子點相比，它不但耐酸耐鹽，水溶性好，而且制備方法簡單，不易聚集，更主要的是制成的量子點硅層薄，粒徑小，F?rster 距離合適，有利于能量轉移的形成，對于制備分子信標十分有益。

另外還有研究報道以 Fe3O4為核層原料，以CdTe 量子點為殼層原料合成了 Fe3O4/CdTe 親水性磁性量子點[18]。再以Fe3O4/CdTe 作為能量供體、3′端修飾有淬滅劑BHQ-2的單鏈DNA作為能量受體合成分子信標，成功構建了熒光共振能量轉移體系。用此方法所制備的探針可利用磁鐵將其與游離的DNA、BHQ-2 進行快速分離。分子信標中大多采用單光子-能量轉移，這種模式在生物檢測中，會受到其自身生物發光的干擾，背景較高。另外由于能量轉移中，很難有供體和受體的激發窗口完全不重合，所以直接激發供體時，受體常常也會被激發從而出現假陽性。針對這樣的問題研究者們設計了雙光子-能量轉移。它可以在近紅外區域被激發，從而克服了以上的問題。此技術也被應用到了量子點分子信標技術中[19]。以水溶性ZnS-CdSe量子點為供體，以羅丹明染料（ROX）為受體制成的分子信標，在波長為800 nm的近紅外光區被激發時，不但避免了受體被激發也消除了生物體中自發熒光的干擾。

1.2 量子點與分子信標DNA鏈的連接

在量子點分子信標中最常用的連接方式是將羧基修飾的量子點與氨基修飾帶有猝滅基團的分子信標 DNA鏈用交聯劑 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞氨鹽酸鹽（EDC）連接[12，20-21]。此方法容易操作，但由于反應過程中需多步純化，使得連接產物穩定性降低。另外連接到量子點上的生物分子的數量也不容易控制。因此有研究采用了鏈親和素修飾的量子點與生物素修飾帶有猝滅基團的分子信標DNA鏈的連接方法制備了量子點分子信標[22]。這種連接方式具有很高的結合效率，并且熱穩定性很好。Cady等[23]將這兩種連接方式進行比較后發現羧基連接的分子信標與目標信號雜交后，熒光信號恢復得更多。這是由于羧基連接分子信標中量子點和猝滅基團距離較小，能量轉移較強，猝滅得較徹底。進而與互補DNA雜交后信號強度增大的就相對較多。除此以外，還有報道Medintz 等[24]利用一個具有巰基活性的組氨酸（6）連接片斷將量子點連接到分子信標上。合成的組氨酸連接片斷純化后一端通過雙硫鍵與5′端巰基化的分子信標DNA片段連接，另一端則通過金屬-組氨酸之間的作用自組裝到CdSe-ZnS核殼量子點上。這種自組裝的連接方式不但有很高的連接親和性而且可以控制連接的量子點上的DNA的量。以上說明，好的連接方式需具有組裝方便、產物穩定以及可控的生物結合效價的特點。

1.3 猝滅劑的選擇

作為猝滅劑，基本要求是其吸收光譜要與能量轉移供體的發射光譜重合。由于二甲氨基偶氮苯甲酰（DABSYL）和黑洞猝滅劑（BHQ-2）對多種發射光譜不同的熒光基團都有很好的淬滅作用，成為分子信標通用的淬滅基團[25-26]。在量子點分子信標中，也經常使用這兩種猝滅基團[13，22，27]。此外也有報道采用Iowa black FQ作為量子點的能量轉移受體[17，23]。研究發現Iowa black標記的分子信標在與互補的 DNA鏈雜交后，熒光強度的恢復是DABSYL標記的分子信標的2倍。相比與這些有機染料，有很多研究發現納米金的猝滅效率更高，幾乎能接近 100%[22，28-31]。用納米金作為量子點分子信標的猝滅基團，不但猝滅效果好，而且可以延長在活細胞和動物體內的檢測時間[14，23]。此外，由于納米金吸收光譜較寬可以作為各種發射波長的QDs的通用受體，構成理想的2D-A、3D-A 的FRET 體系，應用于多組分分析[32-33]。Dong等[34]利用石墨烯作為量子點分子信標的猝滅劑成功的檢測了目標DNA。實驗中沒有目標DNA時，分子信標 DNA鏈與石墨烯的作用使得鏈上的量子點與石墨烯距離很近，因而被猝滅。當有目標DNA時，分子信標DNA鏈與之雜交形成雙鏈后從石墨烯上釋放出來，這時量子點遠離石墨烯，從而熒光得到恢復。這種新方法不但檢測靈敏度和特異性很高，而且無需在分子信標上標記猝滅基團，減少了工作量。

1.4 量子點分子信標的表征

在分子信標探針中，猝滅效率是一個重要的參數，它可以用E=）來表示（R0為F?rster距離，即猝滅效率為50%時的距離，R為供體和受體之間的距離）[35]，也可用熒光劑的熒光發射光譜與淬滅劑的紫外吸收光譜的重疊范圍來直觀地表示[20]。在量子點分子信標的制備中一般都會對此進行考察[11，13，20，22]。此外，量子點分子信標的性能還可以通過將其與完全互補、單堿基錯配及完全不互補的DNA序列進行雜交后熒光強度的恢復來考察它的特異性[13，22]。完全互補時，熒光信號最強；存在單堿基錯配和完全不互補的目標序列時，分子信標的熒光信號則應不能完全恢復。

文獻中也有利用凝膠電泳對合成的產物進行表征[10，21]。由于在相同的電泳時間內，電泳速率不同，分子信標單鏈 DNA＞量子點分子信標＞量子點，故可以將三者區分。進而對合成的量子點分子信標質量進行評價，此法所用儀器簡單，利于操作。然而由于使用電泳對分子信標表征還存在重現性不好等的問題，大多數實驗中還只是在實驗條件優化時利用凝膠電泳進行簡單地考察[22，24，36]。

2 在核酸檢測中的應用

量子點用于分子信標檢測，克服了有機熒光染料的許多不足之處。對于普通的分子信標可以進行的核酸檢測工作，如PCR實時檢測，單堿基突變檢測它都可以完成。此外由于量子點的一些獨特性質，量子點分子信標尤其適用于進行多組分同時測定和體內的檢測。

2.1 多重SNP檢測

通過改變量子點的組成或尺寸，可以使其發射可見光區任一波長的光，也就是說它可以為吸收光譜在可見區的任一生色團提供能量，并且保證了供體發射波長與受體吸收波長的良好重疊，增加了共振能量轉移，所以量子點分子信標可用于多重SNP檢測。Li等[12]利用量子點分子信標和毛細管電泳對兩重單堿基突變進行了檢測。試驗中，針對兩個突變位點，分別設計了兩種不同顏色的量子點分子信標。當分子信標與單堿基錯配的突變型序列雜交反應時，由于雜交反應不能進行，電泳圖上只會出現量子點分子信標的信號峰。如果與完全互補的野生型序列雜交反應時，則電泳圖上除了量子點分子信標的信號峰還會在遷移時間較短的地方出現分子信標與互補序列雜交產物的信號峰。并且由于分子信標被打開，此峰的信號強度會增大。因此當電泳圖上出現4個峰時則兩個被測物均為野生型；3個峰則一個被測物為野生型，一個為突變型；2個峰則均為突變型。此方法靈敏度和特異性都很好，另外由于采用了毛細管電泳，可以有效將雜交后的分子信標和沒有雜交的分子信標分離，從而避免了假陽性的產生。

2.2 細胞內病毒基因的實時檢測

在生物檢測中，活體細胞內的基因表達，特別是病毒基因的實時檢測得到越來越多的重視和應用。如Jerome等[37]考察了流感、托高土、Borna病的負鏈RNA病毒在細胞核內外的運輸過程，Duprex等[38]利用綠色熒光蛋白研究了麻疹病毒在細胞間的傳遞過程，以及M cDonald等[39]利用加強綠色熒光蛋白檢測HIV在感染細胞內的運輸。近年來也有報道利用羧基熒光素標記的分子信標對HAV感染的FRhK-4 細胞的進行檢測[40]。在這些眾多的檢測方法中，分子信標由于特異性高、背景低成為了最有前途的技術。然而傳統的分子信標耐光漂白性較差，不利于長時間的監測，其應用也得到了一定限制。相比而言，量子點的熒光強度和耐光降解都大大增加（大約100倍），從而更加有利于活細胞內的病毒檢測[41]。Yeh等[14]利用量子點-納米金分子信標檢測了布法羅綠猴腎細胞中科薩基病毒。實驗中不但對病毒進行了定量分析，還在熒光顯微鏡下對病毒的復制做了實時的監測。實驗顯示，在細胞被病毒感染1 h后即觀測到量子點的熒光信號。隨著時間的推移，熒光信號越來越強，表明病毒RNA正在不斷的合成和聚集。從6 h后直到12 h，量子點熒光信號進一步的向外擴散，正顯示了子代病毒對細胞的再度感染。由此，量子點分子信標的應用有利于對病毒寄主的相互作用和發病機理的進一步研究。

2.3 細菌內基因的檢測

量子點分子信標由于靈敏度高、特異性好，還可用于微小的細菌內的檢測。有研究報道采用量子點分子信標原位雜交的方法對大腸桿菌中β-內酰胺酶耐藥基因進行了檢測[27]。與之前工作中傳統的原位雜交方法相比[42]，由于分子信標在無目標 DNA時不會打開其莖環結構，因此即使在細菌細胞膜甚至在細胞質中存有分子信標探針也不會產生假陽性信號。同時由于分子信標與目的基因雜交后無需進行洗脫等繁瑣步驟，從而實現了一步原位雜交檢測法。另外量子點分子信標在對目的pUC18基因的特異性結合和背景噪聲的消除中都顯示出了很大的優越性。因此量子點分子信標將有望成為耐藥菌檢測的有效生物探針。

3 結 語

分子信標特異性高且無需分離，在核酸檢測中有著很廣泛的應用。然而其熒光效率卻受限于其閉合形式時不能完全猝滅；打開形式時只有一個熒光基團的發光信號。因此研究者們研究了很多方法來提高其信噪比。如設計in-stem 分子信標[43]、引入多個熒光或猝滅基團[44]或利用共軛聚合物作為發光基團[45]以及采用受激準分子發射[46-47]、電化學發光[48]等方法。量子點具有熒光強度高的特點，使用在分子信標中與靶分子結合后，體系中熒光增強的倍數比傳統熒光試劑要高，所以檢測靈敏度也顯著提高[31]。此外，用量子點制備分子信標還具有抗光漂白、可多重檢測等優點。相信隨著各種新型量子點的出現以及連接、猝滅方式的優化，量子點分子信標必將在基因和醫學檢測方面有更多的應用。

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Preparation of quantum dot-molecular beacon and its application in nucleic acid detection

JIA Huning，YE Baofen，YAN Zhengyu
（Department of Analytical Chem istry，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，Jiangsu，China）

Quantum dots（QDs） have substantial advantages over organic dyes，including high stability against photobleaching，tunable colors by changing particle size，a single wavelength for simultaneous excitation of different-sized QDs and narrow emission peaks. Replacing the organic fluorophores of the conventional molecular beacon w ith QDs w ill overcome its many shortcomings. Quantum dot-molecular beacon is not only sensitive in measurement and stable against photo degradation，but also can be applied for multi-detection. In this paper，the development of quantum dot-molecular beacon in recent years is introduced. The types of MBs，linkage strategies，fluorescence quenchers and the characterization of quantum dot-molecular beacon were summarized. Moreover，its applications on nucleic-acid diagnostics are discussed，including multiple SNP detection，real-time monitoring on the living cells.

quantum dots；molecular beacon；nucleic acid detection；preparation

TB 3

A

1000–6613（2012）05–1071–05

2011-10-25；修改稿日期：2011-11-28。

中國藥科大學青年教師基金。

賈滬寧（1978—），女，講師。E-mail jiahuning@sina.com。聯系人：嚴拯宇，教授，博士生導師。