利用孕婦血漿中胎兒游離DNA進行無創傷性產前基因診斷的研究進展

喻 瓊，鄧志輝

(深圳市血液中心，廣東 深圳 518035)

1997年，Lo等[1]首先發現孕婦血漿中存在游離(cell-free)的胎兒DNA。直接利用孕婦外周血中的胎兒DNA，對胎兒的遺傳信息進行無創傷性產前基因診斷，因無須穿刺或中止妊娠、對胎兒無任何創傷、可在妊娠早期進行、適合于繼續妊娠對象等眾多的優點，倍受臨床圍產醫學研究者的關注和重視。

孕婦血漿中胎兒游離DNA源于胎兒細胞和/或胎盤的凋亡[2，3]，相對含量豐富，在妊娠早期平均為 0.022～0.46ng/ml， 妊娠晚期為 0.46～5.08ng/ml，孕中期和孕晚期的孕婦血漿DNA濃度高于孕早期[4]；并且分娩后，孕婦血漿中胎兒游離DNA很快被清除，不會影響到下次孕娠。因此，胎兒游離DNA成為當前無創傷性產前遺傳分析的重要來源。近年來，國內、外已有較多的應用研究文獻報道。

1 性別遺傳鑒定

目的是為了避免X-連鎖隱性遺傳性疾病，以利于優生優育。目前X連鎖隱性遺傳病有200多種，如杜興肌營養不良，女性攜帶者和正常男性婚配，女嬰為攜帶者的風險為50%；而男嬰則有50%的患病風險。在性別遺傳鑒定方面的研究，開展較早，國內外報道較多。如采用PCR技術、巢式PCR技術、熒光定量PCR方法檢測Y染色體上的SRY基因、鋅指蛋白基因(Zinc finger protein,Y-encoded,ZFY)，以及采用PCR復合擴增和熒光法基因掃描檢測Y-STR等位基因，總符合率與孕周、血漿DNA提取方法及采用的檢測技術等相關，業已報道的總符合率介于90%～100%[5-8]。

2 RhD陰性孕婦的Rh(D)基因檢測

除胎兒性別鑒定外，首先引起研究者重視的是：Rh陰性孕婦的Rh(D)基因檢測[9]。Lo等采用熒光定量PCR技術，檢測12名早孕期、30名中孕期和15名晚孕期RhD陰性孕婦的血漿DNA，除2名早孕期的樣本因模板DNA量少、出現假陰性外，其余的55例樣本的Rh(D)檢測結果完全正確[4]。此后的研究者以Rh(D)基因的不同區域作為靶基因，相繼開展了研究工作，取得了較為可靠的結果[10-13]，特別是中孕期以后孕婦樣本。

3 常染色體STR及X染色體STR基因座檢測

直接利用孕婦血漿總DNA，采用熒光法復合擴增檢測胎兒的常染色體STR等位基因，可獲得男嬰或女嬰的STR遺傳多態性信息。熒光法的檢測所需模板DNA量少、檢測靈敏度高、人為因素造成的誤差小。Pertl等[14]自行合成、標記熒光引物，建立復合擴增系統，檢測12對母-子對，9個STR位點中至少可檢出4個父源性胎兒STR等位基因，檢出率為80%。Nelson等[15]采用熒光法單個位點擴增GATA72E05等5個X-STR基因座，檢測25例孕娠女嬰的孕婦血漿DNA，19例(76%)至少檢出了一個胎兒特異性等位基因，并建議中孕期的孕婦血漿DNA可用于STR遺傳分析。

以往的研究[14，15]只能證實：可以檢測到孕婦不具有的、父源性胎兒STR等位基因(Informative STR allele)，但不能得到明確的胎兒STR基因型；胎兒DNA組分占孕婦血漿總DNA的比例少，若檢出的STR基因峰值低、又恰好處在母親的STR等位基因影子帶的位置，則難于區分是胎兒的STR基因峰，還是母源性STR等位基因的影子帶。因此，根據胎兒游離DNA與母源性DNA分子大小的差異，探索有效方法，從孕婦血漿總DNA中富集胎兒DNA，減少母源性DNA的干擾，可顯著提高胎兒特異性的STR或X-STR基因峰的峰高，Li Ying等[16]研究結果可證明這一點。

4 Y染色體特異STR基因座分型

人類Y染色體特異STR基因座(Y-STR)，為人類男性所特有，理論上與正常女性DNA的反應結果為陰性；特別是在女性DNA含量較高的背景下，受女性成分的干擾小，因而在法醫DNA物證鑒定及無創傷性產前分子遺傳診斷中具有特殊應用價值。鄧志輝等[7]采用ReliageneTMY-PLEX 6熒光復合擴增系統中的6個Y-STR基因座，檢測53份孕期為11～36孕周的孕婦血漿DNA，結果29例孕男嬰的孕婦血漿DNA均檢測出清晰的Y-STR等位基因，每例平均檢出1.8個基因峰，檢出的等位基因與對照組中“丈夫”的Y-STR基因一致。而24例孕女嬰的孕婦血漿DNA均未檢測出Y-STR特異性等位基因。研究還發現：擴增產物片段較短的基因座，等位基因檢出率較高，如DYS393基因座PCR產物大小為113～139 bp，檢出率為100%(29/29)；而PCR產物片段較長的基因座，檢出率較低，說明了胎兒DNA主要是短片段DNA分子組成；改變PCR反應體系和擴增條件，如增加PCR反應中模板DNA量、增加DNA聚合酶用量、增加PCR循環數、采用二次PCR擴增，均未能提高YSTR等位基因的檢出率。

根據胎兒DNA的分子特征，設計PCR引物，進一步縮短Y-STR擴增產物的片段長度，采用擴增產物片段長度在180 bp以下的9個Y-STR基因座組成熒光復合擴增系統，檢測30例孕娠男嬰、34例孕娠女嬰的孕婦血漿DNA[8]，結果孕娠男嬰的孕婦血漿DNA，可檢出4-9個Y-STR等位基因，平均每例檢出7.3個，9個等位基因全部檢出的占12/30；大大提高了Y-STR等位基因的檢出率[8]。研究表明：Y-STR分型除了可應用于胎兒性別遺傳鑒定外，還可獲得男性胎兒遺傳多態性信息，可應用于孕娠男嬰孕婦的無創傷性產前親子鑒定的排除。

5 非整倍性染色體病

Lo等[17]采用定量PCR技術檢測Y染色體特異DNA序列，發現孕婦血漿中21染色體三體綜合癥(唐氏綜合癥)胎兒的DNA濃度顯著升高(1.97倍以上)；Farina等[18]報道孕婦血漿中唐氏綜合癥胎兒的DNA平均濃度為對照組的1.7倍；根據孕婦血漿中胎兒DNA濃度增高并結合其它業已建立的血清生化指標，為21三體綜合癥的篩查提供了可能[9]。研究還發現：孕婦血漿中13三體綜合癥胎兒DNA濃度顯著升高[19]，但18三體綜合癥胎兒游離DNA的濃度與正常對照組差異不大[19，20]；說明不同的胎盤病理條件下，導致胎兒DNA水平的差異。

6 存在的問題和展望

直接利用孕婦血漿中胎兒游離DNA進行無創傷性產前基因診斷，簡便實用，具有廣泛的應用前景。業已開展了胎兒性別鑒定、父源性血型基因檢測、各類STR遺傳標記檢測、胎兒非整倍體病的診斷等應用研究，但當前尚難于作為成熟的技術獨立應用于臨床。

如何避免母源性DNA的干擾，是影響實驗成功的關鍵因素之一。孕婦血漿總DNA，其中大部分為母源性DNA，只有少部分 (約5～7%)為胎兒DNA[2，4]。在以PCR為基礎的分子遺傳診斷中，混合DNA樣本中兩種不同DNA組分所占的比例是至關重要的，含量高的模板DNA組分會產生優勢擴增，而胎兒DNA含量少(如小于5%)，可能會被漏檢。此外，源于胎兒細胞和胎盤細胞經凋亡產生的DNA分子的片段大小，不同于母體血漿DNA分子。母血中胎兒DNA的片段長度要短于母源性DNA，＞99%胎兒 DNA的片段長度在 313bp以下[14，21]。若以100bp SRY序列的相對濃度為100%,則137bp時相對濃度占67%，193bp僅占20%，而313bp時未檢出[21]。因此，孕婦血漿中胎兒DNA不僅是濃度和純度較低，而且主要是短片段DNA分子，這在進行無創性產前分子基因診斷中是不能忽視的。

大規模并行基因組測序技術(massively parallel genomic sequencing)能夠檢測大量的DNA片段[22]，已應用于唐氏綜合癥的診斷研究[23，24]。近年來，Lo等[25]直接利用孕婦的血漿DNA進行全基因組測序，獲得了完整的胎兒及孕婦的基因組序列，構建了全基因組遺傳圖譜，為直接利用胎兒游離DNA開展無創傷性產前基因診斷開辟了新途徑，具有廣泛的應用前景。隨著母血中DNA、mRNA等基礎研究的深入，以及生物醫學技術的進步，無創傷性產前胎兒分子遺傳診斷將不斷取得新的突破，從而對臨床和法醫DNA物證鑒定等產生深遠影響。

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