合并多囊卵巢綜合征產婦胎盤肥胖相關基因多態性研究

顧金萍 陶俊 范建霞

（上海交通大學附屬國際和平婦幼保健院，上海 200030）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是女性最常見的內分泌與生殖功能障礙性疾病，育齡婦女PCOS的患病率約為10%［1］。PCOS病因復雜，可能受遺傳和環境因素共同影響。肥胖相關基因（fat mass and obesity associated gene，FTO）與PCOS發病具有非常密切的關系［2］。在基因組變異中，單核苷酸多態性（single nucleotide polymophism，SNP）是一種主要形式。已有研究［3］顯示PCOS人群FTO基因的SNP與其發病存在關聯。本研究探討PCOS患者的子代是否也具有上述FTO雜合性變異。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2009年6月—2011年4月在上海交通大學附屬國際和平婦幼保健院定期產檢并分娩的孕婦55例，其中28例PCOS治療后孕婦為研究組（PCOS組）（診斷標準嚴格遵照2003年鹿特丹標準）；另27例為年齡、體質量指數（body mass index，BMI）與研究組匹配的健康產婦為對照組。研究組平均年齡（28.63±2.39）歲，對照組平均年齡（28.87±3.18）歲，兩組平均年齡無顯著差異（P＝0.78）。PCOS組孕前平均BMI（23.79±3.42）kg／m2，對照組孕前平均BMI（24.06±3.45）kg／m2，兩組孕前平均BMI無顯著差異（P＝0.776）。

1.2 實驗方法

1.2.1 胎盤組織 DNA抽提 （1）將200μL胎盤組織中加入400μL細胞裂解液混勻，再加入6μL蛋白酶K混勻，置于55℃水浴20min，期間混勻幾次；（2）加入600μL氯仿后充分混勻；（3）12 000r／min，室溫離心2min。離心管內液體呈3層，基因組DNA在上層中，取上層清液500μL，置于無菌1.5mL離心管中；（4）加入500μL沉淀液后混勻，室溫放置2min后以12 000r／min，離心2min；（5）棄上清，立即加入100μL的1.2mol／L氯化鈉溶液，輕輕振蕩直至DNA樣品完全溶解，加入2μL RNA酶，置于37℃10min；（6）加入300μL冰冷乙醇，－20℃放置10min后以12 000r／min，離心5～8min，離心后吸走或倒掉乙醇，用70%乙醇洗1次，倒置室溫干燥10min。然后加入100μL TE溶解DNA。

1.2.2 引物設計及PCR引物設計見表1，擴增成功的PCR產物采用2%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠電泳成像分析儀上觀察結果；然后將目的條帶用ABI Prism 7900HT序列檢測系統進行純化測序，并對測序結果進行分析。

表1 檢測FTO基因rs1421085（C／T）位點SNP的引物序列

1.3 統計學處理 采用SPSS 10.0軟件分析。計數資料以頻數與百分率表示，組間比較采用卡方檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 FTO基因rs1421085（C／T）PCR產物電泳結果 見圖1。如圖中所示，第13～25泳道條帶與標志物位置對比在250bp與500bp之間且靠近500 bp處。而1～12泳道與標志物位置對比顯然與第13～25泳道有異，故切下條帶，繼續測序，進一步明確基因型的差異。

圖1 FTO基因rs1421085電泳結果

2.2 PCR產物的測序結果及分析 對55例孕婦胎盤組織中的FTO基因rs1421085（C／T）PCR產物測序分析后，發現該位點共出現3種基因型，分別為T／T、T／C和C／C基因型。其中T／T基因型共有45例（19例出現在PCOS組，26例出現在對照組），T／C基因型共有8例（7例出現在PCOS組，1例出現在對照組），C／C基因型共有2例（2例均出現在PCOS組）。

2.3 FTO基因rs1421085（C／T）位點的基因型頻率 2組等位基因頻率比較，具有顯著差異（χ2＝7.2160，P＝0.0072）。2組基因型頻率比較，具有顯著差異（χ2＝4.800，P＝0.0285）。

表2 等位基因頻率及基因型頻率比較［n（%）］

3 討 論

FTO基因定位于人類16號染色體長臂，包含9個外顯子，410 507個堿基。FTO基因在胎兒以及成人組織中廣泛表達，尤其在下丘腦、垂體、腎上腺組織和胰島細胞中表達水平較高。研究［4］發現，FTO與肥胖及肥胖相關疾病如2型糖尿病、代謝綜合征的發生相關。攜帶有FTO危險基因型的個體，體質量明顯較大，并且伴有糖耐量下降、胰島素抵抗等內分泌紊亂及代謝綜合征。Gerken等［5］認為，FTO基因催化活性可能是通過去甲基化的機制調節基因的轉錄，進而影響肥胖；也可能是與其同源蛋白ABH2一樣，FTO蛋白充當核酸修復酶的作用。FTO基因的變異可能損傷了基因組的修復過程，從而導致肥胖和代謝綜合征。

本研究收集了PCOS孕婦和正常孕婦胎兒的胎盤組織，分離其基因組DNA，并針對FTO基因SNP位點設計特異性的PCR引物進行擴增。通過PCR產物測序及序列對比，結果顯示正常孕婦胎盤組織FTO基因rs1421085（C／T）SNP基因型以“T／T”為主，而在PCOS孕婦胎盤組織中，FTO基因rs1421085（C／T）SNP位點雜合性突變主要表現為“TT→TC”或“TT→CC”。當FTO基因的SNP位點發生變異時，原本編碼的氨基酸突變成另一種氨基酸，從而導致其最終蛋白質產物出現功能性差異。由此推測，PCOS孕婦子代FTO基因SNP位點的變異率比正常孕婦分娩的胎兒高，PCOS患者子代具有PCOS及肥胖等代謝綜合征的再發風險。

［1］ Goodarzi MO，Dumesic DA，Chazenbalk G，et al.Polycystic ovary syndrome：etiology，pathogenesis and diagnosis［J］.Nat Rev，2011，7（4）：219－231.

［2］ Tan S，Scherag A，Janssen OE，et al.Large effects on body mass index and insulin resistance of fat mass and obesity associated gene（FTO）variants in patients with polycystic ovary syndrome（PCOS）［J］.BMC Med Genet.2010，11：12.

［3］ Barber TM，Bennett AJ，Groves CJ，et al.Association of variants in the fat mass and obesity associated（FTO）gene with polycystic ovary syndrome［J］.Diabetologia，2008，51（7）：1153－1158.

［4］ Wang T，Huang Y，Xiao XH，et al.The association between common genetic variation in the FTO gene and metabolic syndrome in Han Chinese［J］.Chin Med J （Engl）.2010，123（14）：1852－1858.

［5］ Gerken T，Girard CA，Tung YC，et al.The obesity－associated FTO gene encodes a 2－oxoglutarate－dependent nucleic acid demethylase［J］.Science，2007，318（5855）：1469－1472.