轉化生長因子－β1－509基因多態性與絕經后2型糖尿病患者骨密度的關系

陳珂 王博 張秀珍

（1.上海曲陽醫院內分泌科，上海 200092；2.上海市楊浦區中心醫院內分泌科，上海 200090；3.同濟大學附屬同濟醫院，上海 200065）

據世界衛生組織預測，2015年我國糖尿病患病率將超過10%，患者總人數將超過1億［1］。隨著糖尿病發病率和患病率的升高，各種糖尿病慢性并發癥的患病率也逐步攀升。骨代謝異常所致骨質疏松癥（osteoporosis，OP）是糖尿病最常見的慢性并發癥之一。OP與2型糖尿病（type 2diabetes mellitus，T2DM）均是由多種基因共同決定并受環境等因素影響的多發病。婦女在絕經后最初5年中，骨量丟失顯著加速［2］。轉化生長因子－β是調節細胞生長、分化的重要細胞因子，可促進成骨細胞復原和增殖，也可通過調節成骨細胞對骨的沉積作用和破骨細胞對骨的吸收作用而控制骨密度（bone mineral density，BMD）［3］。本研究通過研究轉化生長因子－β1－509（transforming growth factor－Β1－509，TGF－β1－509）基因多態性各等位基因及基因型在絕經后5～10年內T2DM女性中的分布頻率，旨在從基因水平探討T2DM并發OP的遺傳因素。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2007年2月—2011年12月同濟大學附屬同濟醫院內分泌科就診的上海地區漢族絕經女性患者共282例，其中OP患者105例（OP組），T2DM患者骨量正常患者90例（T2DM組），T2DM并發OP患者87例（T2DM 并發OP組）；另選取健康絕經女性82例作為對照 （對照組）。所有研究對象半年內未服用性激素、甲狀旁腺激素、雙磷酸鹽、降鈣素、糖皮質激素等影響骨代謝的藥物。糖尿病診斷符合1999年美國糖尿病協會（American Diabetes Association，ADA）診斷標準，即空腹血糖＞7.0mmol／L，餐后2h血糖＞11.1mmol／L；OP的診斷標準［4］：BMD低于同性別峰值BMD平均值2.5個標準差值（T ≤－2.5）。

1.2 研究方法 所有研究對象均測量身高、體質量、計算體質指數（body mass index，BMI）。均于早晨抽空腹肘靜脈血5mL，－80℃保存。采用高壓液相法測定糖化血紅蛋白 A1c（hemoglobin A1c，HbA1c）。基因組DNA的提取采用基因組DNA快速提取試劑盒。

1.3 BMD測定 采用美國Lunar公司生產的DEXA BMD測量儀，測定第2～4腰椎（L2－4）的BMD（g／m2）。每次測量前均行體模測試，BMD測量的變異系數（CV）為0.24%～0.69%。

1.4 TGF－β1－509 基 因 分 型 上 游 引 物 5＇－CTC CAT TTC CAG GTG TGG TCC CA－3＇，下游引物5＇－CAC CAA AGC GGG TGA TCC AGA T－3＇。以100ng DNA為模板在25μL反應容積中進行聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）。以限制性內切酶Eco 81Ⅰ（北京紐英倫生物技術有限公司）在37℃酶解PCR產物2h，最后經3%瓊脂糖凝膠電泳分離酶解產物片段。如果－509位點為C則會被內切酶Eco 81Ⅰ切成237bp和628bp2個片段；如果－509位點為T則不會被內切酶Eco 81Ⅰ切開，只顯示1條865bp的片段。

1.5 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（ˉx±s）表示。組間比較用單因素方差分析（ANOVA）與最小顯著差法（least significant difference，LSD）兩兩比較以及兩因素方差分析（two way ANOA）。計數資料以頻數與百分率表示，組間比較采用卡方檢驗（χ2檢驗）。雙側檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 一般情況 OP組、T2DM組、T2DM并發OP組與對照組的年齡、絕經年限、BMI、HbA1c、L2－4 BMD以及TGF－β1－509基因型和等位基因分布頻率比較見表1。

2.2 TGF－β1－509基因型和等位基因分布頻率的比較 OP組、T2DM組、T2DM并發OP組和對照組TGF－β1－509等位基因型 C、T 的分布無顯著差異（χ2＝1.992、0.400、1.766；P＝0.158、0.527、0.184）。合并OP組（OP組＋T2DM并發OP組）和非OP組（T2DM組＋對照組）等位基因型C、T的分布頻率差異有統計學意義（χ2＝5.966，P＝0.015），見表2。

2.3 TGF－β1－509基因型與L2－4BMD的關系 OP組、T2DM組、T2DM并發OP組和對照組CC基因型、CT基因型、TT基因型比較，各組L2－4BMD都呈CC＞CT＞TT趨勢，但無顯著差異，各基因型組間兩兩比較差異均無統計學意義，見表3。合并OP組和非OP組CC基因型、CT基因型、TT基因型比較，各組的L2－4BMD都呈CC＞CT＞TT趨勢，但無顯著差異，各基因型組間兩兩比較差異均無統計學意義，見表4。

表1 OP組、T2DM組、T2DM并發OP組與對照組相關指標比較（ˉx±s）

表2 OP組與非 OP組TGF－β1－509等位基因分布頻率比較n（%）

表3 OP組、T2DM組、T2DM＋OP組和對照組TGF－β1－509基因多態性與L 2～4BMD的關系（ˉx±s，g／cm2）

表4 OP組和非 OP組TGF－β1－509各基因型L 2～4BMD測定結果（ˉx±s，g／cm2）

2.4 TGF－β1－509基因多態性與糖代謝的關系T2DM組和T2DM并發OP組TGF－β1－509基因位點CC基因型、CT基因型、TT基因型比較，HbA1c差異均無統計學意義。各基因型組間兩兩比較差異均無統計學意義，見表5。

表5 T2DM 組和T2DM＋OP組TGF－β1－509各基因型HbA1c測定結果（ˉx±s，g／cm2）

3 討 論

TGF－β可刺激成骨細胞增殖、分化，促進細胞外基質合成，可促進骨與軟骨形成，加速破骨細胞凋亡。體外實驗研究［5］結果表明，TGF－β有強大骨形成和骨修復作用，可使骨密度增加。TGF－β對破骨細胞的作用表現為減少破骨細胞的數量和抑制單個破骨細胞的骨吸收活性。破骨細胞通過對骨基質進行酸性水解溶解骨質，同時破骨細胞造成的酸性環境也可激活 TGF－β。文獻［6］報道 TGF－β1基因啟動子－509位點T等位基因可能提高TGF－β1的轉錄水平，從而增加TGF－β1基因的表達。本研究中合并OP組各基因型組L2－4BMD值都呈現CC＞CT＞TT的趨勢，提示隨著T等位基因的增多，TGF－β1表達增多，從而影響BMD。但合并OP組與非OP患者比較BMD差異無統計學意義，原因可能為：（1）不同基因之間存在復雜的交互作用，BMD受多個基因調控，多個易感基因組合構成了該病的遺傳易感性，單一基因作用可能有限；（2）環境因素，遺傳和環境之間存在復雜的交互作用，生活習慣、體育鍛煉、飲食營養狀況以及鈣、維生素D攝取水平等對研究結果有很大影響；（3）本研究樣本量小，混雜因素多。因此，有待對不同種族、不同人群進一步設計更嚴密的大樣本研究。

本研究對 TGF－β1－509基因多態性與 HbA1c水平相關性的研究，在國內外尚屬首次。T2DM組、T2DM 并發OP組的HbA1c水平在TGF－β1－509基因多態性的3組基因型之間差異均無統計學意義。因此，TGF－β1－509基因多態性可能無法預測T2DM患者及T2DM并發OP患者骨代謝和糖代謝的水平，其原因可能為HbA1c更多反映的是糖尿病的治療效果，而且受到藥物、飲食等的影響。

本研究結果表明，TGF－β1－509等位基因型 T可能是OP的易感基因，T2DM患者TGF－β1－509基因型與HbA1c無相關性，由于樣本量較小，尚需進一步研究。

［1］ 徐炯，劉軍，查英，等.上海市閔行區江川社區老年糖尿病患病率調查［J］.中國臨床醫學，2011，18（2）：198－200.

［2］ Anaforoglu I，Nar－Demirer A，Bascil－Tutuncu N，et a1.Prevalence of osteoporosis and factors affecting bone mineral density among postmenopausal Turkish women with type 2diabetes［J］.Diabetes Complications，2009，23（1）：12－17.

［3］ Jian H，Shen X，Liu I，et al.Smad3－dependent nuclear translocation of beta－catenin is required for TGF－beta1－induced proliferation of bone marrow－derived adult human mesenchymal stem cells［J］.Genes Dev，2006，20（6）：666－674.

［4］ 中華醫學會骨質疏松和骨礦鹽分會.原發性骨質疏松診治指南［J］.中華骨質疏松和骨礦鹽疾病雜志，2011，4（1）：2－17.

［5］ Janssens K，ten Dijke P，Janssens S，et al.Transforming growth factor－beta1to the bone［J］.Endocr Rev，2005，26（6）：743－744.

［6］ Silverman ES，Palmer LJ，Subramaniam V，et al.Transforming growth factor－β1promoter polymorphism C－509Tis associated with asthma［J］.Am J Respir Crit Care Med，2004，169（2）：214－219.