血管性癡呆大鼠模型的改良

竇金金，謝寧，吳頌，史瑞，張真

(1.黑龍江中醫藥大學研究生學院，哈爾濱150040;2.天津中醫藥大學第二附屬醫院急癥部)

改良2-血管阻斷法(2-VO)+硝普鈉降壓是血管性癡呆(VD)研究中常用的模型之一［1］。此法制作模型可重復性、穩定性較好，其優點為手術操作簡單，對動物創傷較小，易于恢復，尤其是以學習記憶能力低下為主要特點，與臨床“血管性癡呆”的發病過程相似，存活率較高。適用于研究血管性癡呆的病理生理機制和評價藥物的作用。傳統方法分離雙側頸總動脈，腹腔注射硝普鈉造成低血壓，夾閉雙側頸總動脈10 min，再通10 min，如此反復2次，撤線，縫合傷口。本文擬對傳統方法進行改良，探討延長雙側頸動脈夾閉時間并增加夾閉次數建立VD模型的成功率。

1 材料和方法

1.1 模型的復制 將購買的雄性Wistar大鼠(由本校實驗動物室提供)20只，體質量220～250 g，適應性飼養2周后，隨機分為腦缺血模型組、假手術對照組，每組10只。各組大鼠手術前后均常規飼養。將大鼠用10%烏拉坦(1 mg/kg，腹腔注射)麻醉后，仰臥固定在手術臺上，常規消毒，頸正中切口，分離雙側頸總動脈(CCA)，模型組在夾閉雙側CCA之前，腹腔注射硝普鈉(北京雙鶴制藥廠，2.5 mg/kg，用無菌蒸餾水溶解)，隨即用無創動脈夾夾閉雙側CCA，20 min 后，再通 10 min，再夾閉 20 min，再通10 min，再夾閉20 min再通后縫合傷口，術后于頸動脈傷口處均勻撒入青霉素鈉鹽。假手術組麻醉及手術過程與模型組相同，但不阻斷CCA及注射硝普鈉。在全部造模過程中保持動物直腸溫度在37℃左右，以防止低溫對腦缺血損傷的保護作用。

1.2 行為學測定 術后觀察大鼠一般情況及成活率，于術后28 d使用Morris水迷宮對大鼠進行學習記憶能力的測定［2］。

定位航行試驗:在水池里注入清水，使水面高出平臺1～2 cm，水溫控制在(24±2)℃左右，水池等分為4個象限(從右上、左上、左下、右下分別是一至四象限)。將平臺放在第四象限中間，在其他三個象限任選一點面向水池池壁將鼠放入水中，試驗歷時4 d，每天上午每個象限各測試1次，每次測試1 min。若大鼠在1 min之內尚未找到平臺，則將鼠拿到平臺上并使它在上面站10 s，則其潛伏期為1 min;若鼠在1 min之內找到平臺，也讓其在平臺上站10 s，方結束一次訓練，如此訓練4 d。記錄大鼠分別在三個象限找到平臺所需時間(即潛伏期)，計算平均值。

空間探索試驗:在行為學測試第5天下午，定位航行試驗結束后，撤除平臺，然后從原始平臺對側象限入水點將大鼠放入水中，測其1 min內經過原始平臺位置的次數以及平臺象限游程占總游程的百分比。

1.3 形態學觀察 行為學測試完成后，斷頭處死動物，取腦組織固定，取視交叉后4 mm處至小腦前的腦組織，然后做Nissl染色，光鏡觀察海馬細胞形態變化。

1.4 統計學處理 采用SPSS10.0軟件，數據分析運用t檢驗。

2 結果

2.1 基本情況 1周內體質量明顯減輕，活動減少，飲食差，毛發蓬松且易脫落。手術28 d后，模型組存活9只，存活率與正常組差異無統計學意義。

2.2 行為學指標 在Morris水迷宮實驗中，模型組路徑比正常組明顯延長，潛伏期明顯延長，穿越平臺次數明顯減少、平臺象限游程占總游程的百分比也顯著降低，見表1，2。

表1 兩組大鼠水迷宮定位航行實驗結果(±s，m)

表1 兩組大鼠水迷宮定位航行實驗結果(±s，m)

注:與對照組比較，aP＜0.01

組別 鼠數(只) 第1天 第2天 第3天 第4天對照組 10 25.39 ±5.92 21.52 ±7.04 17.08 ±3.97 10.72 ±4.80模型組 9 48.59 ±6.27a45.92 ±8.01a41.12 ±5.80a35.65 ±4.37a

表2 兩組大鼠水迷宮空間探索實驗結果(±s)

表2 兩組大鼠水迷宮空間探索實驗結果(±s)

注:與對照組比較，aP＜0.01

組別 鼠數(只) 穿越平臺次數平臺象限游程占總游程的百分比(%)對照組10 6.62 ±2.23 39.47 ±8.07模型組 9 3.50 ±1.61a 26.45 ±4.31a

2.3 病理學變化 光鏡下觀察:對照組海馬CA1區錐體細胞排列緊密有序，細胞核圓而大，邊界及核仁清晰，胞漿內尼氏體豐富，而且均勻分布，神經纖維排列整齊;模型組海馬CA1區錐體細胞大小排列紊亂、稀疏，細胞間隙增大，胞漿內尼氏體減少或消失，有數量不等的小空泡，呈均勻淡藍色，細胞核變小，結構不清，核仁消失，神經纖維排列紊亂，神經元脫失現象明顯。

3 討論

VD是由一系列腦血管因素導致腦組織損害引起的癡呆綜合征。患者表現為記憶及認知等功能障礙綜合征，不僅嚴重損害患者的健康，影響患者的生命質量，也給家庭和社會帶來沉重的負擔［3-4］。在我國11個城市流行病學調查結果發現，60歲以上人群中VD的患病率為324/10萬人口，老年性癡呆(AD)為238/10萬人口，VD占各類癡呆的第1位。VD患者的平均生存時間為41個月，5年內死亡率達60%以上［5］。并且隨著人類社會的老齡化，VD已是國內外醫學界研究的重要課題，由于對本病的發病機制尚不十分明確，亦缺少治療本病的特效藥物，因此建立理想的VD動物模型對于探明VD的病因、病理過程以及尋找和篩選防治藥物具有重要意義。

我們通過實驗發現只要硝普鈉注射量準確、可靠，操作者手法熟練同時環境溫度恒定，適當延長雙側頸總動脈夾閉的時間并且增加夾閉次數沒有嚴重影響大鼠的成活率，并且在術后通過對Morris水迷宮檢測，模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長，在規定時間內穿越平臺的次數明顯減少，空間記憶障礙明顯，成功建造了大鼠癡呆模型。形態學觀察可見明顯的CA1區錐體細胞的變性、死亡、甚至丟失，這一變化印證了行為學的結果。而且動物沒有明顯的運動系統損傷表現，存活率較高。

［1］ 王蕊，楊秦飛，唐一鵬，等.大鼠擬血管性癡呆模型的改進［J］.中國病理生理雜志，2000，16(10):914-916.

［2］ Vorhees CV，Williams MT.Morris water maze procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory［J］.Nature Protocols，2006，1(2):848.

［3］ 俞德彩，張艷艷，劉巧玲.血管性癡呆與頸動脈粥樣硬化的相關性研究［J］.中國臨床保健雜志，2005，8(2):118-119.

［4］ 何靜，謝道俊.血管性癡呆的中醫藥治療［J］.中國臨床保健雜志，2009，12(1):94-96.

［5］ Bomebroke M，Breteler NM.Epidemiology of non-AD dementias［J］.Clin Neurosic Res，2004，3(6):349-361.