p53蛋白、ki-67抗原和表皮生長(zhǎng)因子受體在胃癌組織的表達(dá)及意義

黃利，彭瓊，甘惠中，嚴(yán)軍寧

(安徽醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院、合肥市第一人民醫(yī)院，a消化內(nèi)科，b病理科，合肥230061)

胃癌是常見消化道腫瘤之一，其生長(zhǎng)分化和侵襲轉(zhuǎn)移過程中有諸多(抑)癌基因參與。近年來，隨著分子生物學(xué)研究的深入，腫瘤預(yù)后指標(biāo)由簡(jiǎn)單的病理分期、組織學(xué)類型，增加到針對(duì)性更強(qiáng)的組織生物學(xué)指標(biāo)檢測(cè)。本研究采用免疫組織化學(xué)MaxVisionTM2/HRP染色法檢測(cè)胃癌組織中 p53蛋白、ki-67抗原和表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)三種癌相關(guān)基因蛋白產(chǎn)物，觀察其臨床病理特征及其與預(yù)后的關(guān)系，以期為胃癌預(yù)后判斷及臨床治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集合肥市第一人民醫(yī)院2006年2月至2010年10月手術(shù)切除且臨床資料完整的胃癌組織標(biāo)本66例(男50例，女16例)，所有病人術(shù)前均未經(jīng)放化療等抗癌治療。年齡36～82歲，平均(64.2±10.0)歲;其中＜60歲者16例，≥60歲者50例。

病灶部位:胃竇部25例、胃體部13例、胃底賁門部28例。腫瘤長(zhǎng)徑≤5 cm 51例、＞5 cm 15例。

病理分型:高分化腺癌17例，中低分化腺癌38例，黏液腺癌及印戒細(xì)胞癌11例。腫瘤侵犯深度:肌層內(nèi)27例、肌層～漿膜外39例。發(fā)生局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者42例，無局部淋巴轉(zhuǎn)移者24例。根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)2009年第7版胃癌TNM分期方法進(jìn)行臨床分期:Ⅰ期19例，Ⅱ期14例，Ⅲ期29例，Ⅳ期4例。

1.2 主要試劑與方法

1.2.1 主要試劑 鼠抗人Ki-67單克隆抗體(工作液)、鼠抗人EGFR單克隆抗體(工作液)、鼠抗人p53單克隆抗體(工作液)、二抗(即用型 MaxVisionTM2/HRP試劑盒)、DAB顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.2.2 免疫組織化學(xué)方法 所有組織標(biāo)本均經(jīng)40 g/L中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，分別進(jìn)行HE染色和MaxVisionTM2/HRP法免疫組織化學(xué)染色，染色步驟按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。p53、Ki-67采用高壓熱修復(fù)2 min，pH值6.0;EGFR采用煮沸抗原修復(fù)20 min，pH 值8.5～9.0。以 PBS液代替一抗做陰性對(duì)照;以己知的陽性切片作陽性對(duì)照。

免疫組織化學(xué)染色主要步驟為:4 μm石蠟切片脫蠟和水化后，根據(jù)第一抗體的要求，對(duì)組織進(jìn)行相應(yīng)的抗原修復(fù);除去PBS，切片上滴加第一抗體，室溫下孵育120 min或4℃過夜，PBS沖洗3×3 min;除去PBS，切片上滴加即用型MaxVisionTM2/HRP試劑，室溫下孵育15 min，PBS沖洗3×3 min;除去PBS，切片上滴加新鮮配制的加強(qiáng)型DAB顯色試劑顯色;自來水沖洗終止顯色，蘇木素復(fù)染，(如有必要可用0.1%鹽酸乙醇分化)，PBS返藍(lán)，經(jīng)梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.2.3 陽性結(jié)果判斷 在高倍視野下觀察腫瘤細(xì)胞，p53蛋白陽性表達(dá)為細(xì)胞核呈棕褐色顆粒;Ki-67抗原陽性表達(dá)為細(xì)胞核呈棕褐色顆粒，光鏡下每例隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，陽性細(xì)胞數(shù)＜25%為1級(jí)，26% ～50%為2級(jí)，51%～75%為3級(jí)，＞76%為4級(jí)，2級(jí)以上為陽性;EGFR陽性表達(dá)為細(xì)胞漿和部分細(xì)胞膜染成棕黃色，胞槳內(nèi)呈棕黃色顆粒。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0軟件，陽性表達(dá)率的比較用采用卡方檢驗(yàn)(χ2檢驗(yàn))或Fisher確切概率法。

2 結(jié)果

2.1 p53蛋白、ki-67抗原、EGFR在胃癌組織中的表達(dá) p53蛋白、ki-67抗原主要表達(dá)在細(xì)胞核，EGFR主要表達(dá)于胞核和胞漿(見圖3)。各分子標(biāo)記物在胃癌組織中的陽性表達(dá)率為:p53蛋白53.03%(35/66)，ki-67 抗 原 62.12%(41/66)，EGFR 42.42%(28/66)。66例胃癌的臨床病理特征與各分子標(biāo)記物表達(dá)之間的關(guān)系見表1。

表1 p53、ki-67、EGFR各分子標(biāo)記物表達(dá)與胃癌臨床特征之間的關(guān)系(例)

2.2 p53、ki-67、EGFR聯(lián)合檢測(cè)與與胃癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 p53、ki-67、EGFR三者聯(lián)合檢測(cè)陽性率(見表2)，在胃癌浸潤(rùn)深度T1時(shí)為0/9，而與其他浸潤(rùn)深度(9/9)對(duì)比明顯不同;在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者為2/9，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者為7/9，也有一定差別。p53、ki-67兩者聯(lián)合檢測(cè)及p53、ki-67、EGFR三者聯(lián)合檢測(cè)均在不同胃癌TNM分期之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 p53、ki-67、EGFR聯(lián)合檢測(cè)陽性表達(dá)與胃癌臨床病理特征之間的關(guān)系(例)

3 討論

p53作為對(duì)細(xì)胞分裂與增殖起負(fù)調(diào)控作用［1］的抑癌基因，是人類腫瘤相關(guān)性最高的基因。突變型p53蛋白較野生型p53蛋白半衰期長(zhǎng)且穩(wěn)定，故目前免疫組織化學(xué)檢測(cè)的p53蛋白均為突變型。研究發(fā)現(xiàn)超過60%的胃癌中出現(xiàn)p53基因突變［2］，p53蛋白在胃癌中表達(dá)率 25.2% ～65.12%［3-4］，有研究顯示p53蛋白高表達(dá)與胃癌位于賁門部［5］、腫瘤直徑 ＞5 cm、TNM 分期差［6-7］、分化程度低［8］等有關(guān)，與胃癌的總生存率及腸型胃癌的生存率有關(guān)［5］;也有報(bào)道，p53的表達(dá)與胃癌腫瘤直徑、分化程度、浸潤(rùn)深度和有無淋巴轉(zhuǎn)移無關(guān)，與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有顯著性相關(guān)［9］。本研究結(jié)果提示胃癌中p53蛋白陽性表達(dá)率53.03%(35/66)，胃癌長(zhǎng)徑＞5 cm者、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者p53蛋白表達(dá)率明顯高于≤5cm者、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，說明p53過表達(dá)參與胃癌的發(fā)生、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，可作為胃癌患者預(yù)后評(píng)估的一項(xiàng)參考指標(biāo)。

ki-67為敏感的細(xì)胞核增殖標(biāo)記物，用于判斷腫瘤的增殖活性。多個(gè)研究顯示ki-67抗原高表達(dá)與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)［10-13］，與胃癌的侵襲、低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)［11］，而與患者年齡、性別，胃癌TNM分期無關(guān)［14］。但也有研究顯示Ki-67表達(dá)與胃癌的生長(zhǎng)方式、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否及TNM分期無關(guān)，僅與分化有關(guān)［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，高分化胃腺癌ki-67陽性表達(dá)率低于中低分化胃腺癌、印戒細(xì)胞癌及黏液腺癌，提示ki-67陽性表達(dá)率越高，胃癌分化類型越差，因而其預(yù)后越差。

EGFR是原癌基因c-erbB-1的表達(dá)產(chǎn)物，具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、黏附、血管生成等作用，在多種惡性腫瘤中高表達(dá)。有研究認(rèn)為EGFR高表達(dá)是胃癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，也有文獻(xiàn)報(bào)道EGFR在胃癌中表達(dá)很低。本研究結(jié)果顯示胃癌浸潤(rùn)至漿膜者、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者EGFR陽性表達(dá)率明顯高于浸潤(rùn)肌層以內(nèi)者、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，提示EGFR高表達(dá)與胃癌浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移有關(guān)。

鑒于單獨(dú)檢測(cè)p53蛋白、ki-67、EGFR表達(dá)文獻(xiàn)報(bào)道的不確定性，本研究進(jìn)一步分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn):p53、ki-67、EGFR三者同時(shí)陽性表達(dá)為9例，其中腫瘤浸潤(rùn)深度T1時(shí)為0/9，在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者為2/9，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者為7/9，提示與胃癌的侵襲性密切相關(guān);TNM分期Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ者與Ⅰ者p53蛋白、ki-67、EGFR三者同時(shí)陽性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，依據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟推出的第7版的TNM分期，T或N分期各亞組患者之間的5年累積生存率(5YSR)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，如ⅠA患者的5YSR為95.1%，ⅡA期為84.0%，ⅡB期為71.7%，ⅢA 期為58.4%，ⅢB期為41.3%，ⅢC期為26.1%等，據(jù)此我們認(rèn)為p53蛋白、ki-67、EGFR聯(lián)合檢測(cè)與胃癌TNM分期相關(guān)，對(duì)胃癌預(yù)后的評(píng)估有重要意義。

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